一种抗凝血因子XI活化形式因子XIa的抗体及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种抗凝血因子XI活化形式因子XIa的抗体及其制备方法和应用，所述抗体的抗原结合片段的重链可变区的CDR包括如SEQ ID NO:1‑3所示的氨基酸序列，轻链可变区的CDR包括如SEQ ID NO:4‑6所示的氨基酸序列，所述抗体能够特异性结合FXIa但是不与FXI结合，具有抑制人凝血的内源性途径、但不影响外源性途径的作用，能够显著抑制动静脉分流血栓形成，但是不增加出血时间和出血量，具有成为抗血栓药物的潜能。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种抗体及其制备方法和应用，尤其涉及一种抗凝血因子XI活化形式因子XIa的抗体及其制备方法和应用。

背景技术

血液凝固是一个复杂的过程，大致分为三个阶段：凝血酶原激活物形成、凝血酶原转化为凝血酶和纤维蛋白原转化为纤维蛋白。凝血酶原激活物形成有两类不同的机制，分别为内源途径和外源途径，这两类机制汇总于凝血酶形成和纤维蛋白形成，因此后两者也被称为共同途径。凝血反应采用级联机制逐级放大凝血信号，其生物化学实质是血浆中的凝血因子的一系列酶反应，上游因子活化其下游因子，最终将可溶性纤维蛋白原(FI)转变为不可溶的纤维蛋白(FIa)。

凝血因子XI的活化形式因子XIa(Factor XIa，FXIa)是由酶原凝血因子XI(FactorXI，FXI)经剪切而产生的凝血酶，参与内源性凝血通路。人FXI基因位于4号染色体上(4q32-35)，全长为23kb，包含15个外显子。人FXI蛋白分子量为160kD，为同型二聚体结构；每个亚基由607个氨基酸组成，包含一条重链和一条轻链，其中，重链含有4个Apple结构域(Adomain)，轻链主要是酶活性区。人体内的FXI蛋白主要由肝细胞合成，血浆中的FXI浓度约为5μg/mL，半衰期约为52小时。在凝血通路中，FXI能够被活化的凝血因子FXII(FXIIa)和凝血酶(thrombin)激活，生成FXIa，进而激活FIX及下游凝血反应。

FXI缺失的人群通常不会导致自发性出血，无出血或只有非常轻微的出血倾向。最近的流行病学研究表明，FXI缺失与缺血性脑卒中导致的死亡风险成负相关。在FXI缺失的人群中，由血栓引起的缺血性中风的发病率明显低于正常人群。而在FXI表达水平高的人群中，静脉血栓的发病率要高于正常人群。在一例FXI反义核苷酸的二期临床实验中，200mgFXI反义核苷酸可以显著降低膝关节置换手术病人的深静脉血栓的发生率，并且没有增加受试人群的出血风险。由此可见，FXI及其所在的内源性凝血途径可能在病理状态下的体内血栓形成中起到重要作用。因此，FXI、尤其是其活化形式FXIa，是一个比较理想的抗血栓治疗靶点。

CN104684932A公开了能够结合凝血因子XI和/或其活化形式因子XIa的抗体及其用途，所述单克隆抗体能够抑制血小板聚集并由此抑制血栓形成而不会损害止血，但所述单克隆抗体对FXI和FXIa均有结合作用。

CN107922505A公开了凝血因子XI抗体及使用方法，所述抗体结合在FXI和/或FXIa的催化结构域内，不具有特异性结合FXI或特异性结合FXIa的功能。

因此，现有技术凝血因子XI抗体对FXI和FXIa均有结合作用，对FXIa不具有特异性结合功能，而FXIa较FXI是更为理想的抗血栓治疗靶点，筛选得到特异性结合FXIa的抗体，在病理性血栓治疗领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种抗凝血因子XI活化形式因子XIa的抗体及其制备方法和应用，所述抗体能够特异性结合FXIa但是不与FXI结合，具有成为抗血栓药物的潜能。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种抗原结合片段，所述抗原结合片段的重链可变区的CDR包括如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列；

所述抗原结合片段的轻链可变区的CDR包括如SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为：ELSMH；

SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列为：GFDPEDGETIYAQKFQG；

SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列为：DRPVRGVIPYYYYYGMDV；

SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列为：SGSRSNIGSRPVN；

SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列为：IDHQRPS；

SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列为：AAWDDSLDAYV.

优选地，所述抗原结合片段的重链可变区的CDR包括如SEQ ID NO:7-9所示的核酸序列；

SEQ ID NO:7所示的核酸序列为：GAATTATCCATGCAC；

SEQ ID NO:8所示的核酸序列为：

GGTTTTGATCCTGAAGATGGTGAAACAATCTACGCACAGAAGTTCCAGGGC；

SEQ ID NO:9所示的核酸序列为：

GATCGGCCGGTTCGGGGAGTTATTCCTTACTACTACTACTACGGTATGGACGTC.

优选地，所述抗原结合片段的轻链可变区的CDR包括如SEQ ID NO:10-12所示的核酸序列；

SEQ ID NO:10所示的核酸序列为：

TCTGGAAGCCGCTCCAACATCGGAAGTAGGCCTGTAAAC；

SEQ ID NO:11所示的核酸序列为：ATTGATCATCAGCGGCCCTCA；

SEQ ID NO:12所示的核酸序列为：

GCAGCATGGGATGACAGCCTGGATGCTTATGTC.

优选地，所述抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列为：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDRPVRGVIPYYYYYGMDVWGQGTLVTVSS.

优选地，所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列为：

QSALTQPPSASGTPGQTVTISCSGSRSNIGSRPVNWYQHLPGTAPKLLIYIDHQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSDDEADYYCAAWDDSLDAYVFGTGTKVTVL.

优选地，所述抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO:15所示的核酸序列；

SEQ ID NO:15所示的核酸序列为：

CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGATACACCCTCACTGAATTATCCATGCACTGGGTGCGACAGGCTCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGTTTTGATCCTGAAGATGGTGAAACAATCTACGCACAGAAGTTCCA GGGCAGAGTCACCATGACCGAGGACACATCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAACAGATCGGCCGGTTCGGGGAGTTATTCCTTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCTCGAGC.

优选地，所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQ ID NO:16所示的核酸序列；

SEQ ID NO:16所示的核酸序列为：

CAGTCTGCCCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGACGGTCACCATCTCTTGCTCTGGAAGCCGCTCCAACATCGGAAGTAGGCCTGTAAACTGGTACCAGCACCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATATTGATCATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGACGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGGATGCTTATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTA.

第二方面，本发明提供了一种抗凝血因子XI活化形式因子XIa的抗体，所述抗体包括如第一方面所述的抗原结合片段。

优选地，所述抗体还包括人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区中的任意一种或至少两种的组合，优选为人源IgG1恒定区。

根据本发明，人血浆中FXI和FXIa的浓度分别约为5μg/mL(30nM)和0.6ng/mL(4pM)，同时基于人体内约52小时的FXI的半衰期，肝脏中新合成的FXI能达到每天～16mg，由此可见人体内FXI的浓度远远高于FXIa的浓度，因此筛选仅与FXIa结合、但是不与FXI结合的抗体，相比于既与FXIa结合、又与FXI结合的抗体，可以远远降低在临床应用时的给药量。此外，只结合FXIa的抗体比既能结合FXIa又能结合FXI的抗体，在临床上的安全性更高。

本发明中，抗体与FXIa具有较强的结合力，但是不与FXI结合，能够增加活化部分凝血活酶时间，对凝血酶原时间不具有显著影响，具有抑制人凝血的内源性途径、但不影响外源性途径的作用。

第三方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括编码如第一方面所述的抗原结合片段和/或如第二方面所述的抗体的DNA片段。

第四方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括如第三方面所述的核酸分子。

优选地，所述表达载体包括pcDNA3.3表达载体。

第五方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞转染有如第三方面所述的核酸分子和/或如第四方面所述的表达载体。

优选地，所述宿主细胞包括哺乳动物细胞，优选为中国仓鼠卵巢细胞。

第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的抗原结合片段和/或如第二方面所述的抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA片段连接入表达载体，转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；

(2)将筛选后的表达载体转入宿主细胞，培养并收集上清液，分离纯化得到所述抗体。

第七方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的抗原结合片段、如第二方面所述的抗体、如第三方面所述的核酸分子、如第四方面所述的表达载体或如第五方面所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第八方面，本发明提供了一种治疗剂，所示治疗剂与如第一方面所述的抗原结合片段、如第二方面所述的抗体、如第三方面所述的核酸分子、如第四方面所述的表达载体、如第五方面所述的宿主细胞或如第七方面所述的药物组合物中的任意一种或至少两种的组合相连接。

优选地，所示治疗剂还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第九方面，本发明提供了一种如第一方面所述的抗原结合片段、如第二方面所述的抗体、如第三方面所述的核酸分子、如第四方面所述的表达载体、如第五方面所述的宿主细胞、如第七方面所述的药物组合物或如第八方面所述的治疗剂在制备抗血栓药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的14624单克隆抗体与FXIa结合力强，EC50为0.056nM，但是不与FXI结合，14624单克隆抗体与FXIa具有高亲和力，K_D为2.314E-11M；

(2)本发明的14624单克隆抗体增加aPTT，但对PT无明显影响，具有抑制人凝血的内源性途径、但不影响外源性途径的作用；

(3)本发明的14624单克隆抗体对FXIa介导的FIX转变为其活性形式FIXa具有显著的抑制作用，能够抑制FXI介导的FIXa生成；

(4)本发明的14624单克隆抗体对FXIa具有特异性抑制作用，对内源性外源性凝血通路上的其他凝血因子无特异性结合；

(5)本发明的14624单克隆抗体能够显著抑制动静脉分流血栓形成，但是不增加出血时间和出血量，能够显著升高aPTT，但是不影响PT和血小板计数；

(6)本发明的14624单克隆抗体具有作为抗血栓药物的潜能。

附图说明

图1(A)为单克隆抗体14624与抗原人FXIa的结合曲线，图1(B)为单克隆抗体14624与FXI的结合曲线；

图2(A)为单克隆抗体14624在人血浆中对活化部分凝血活酶时间(aPTT)的影响，图2(B)为单克隆抗体14624在人血浆中对凝血酶原时间(PT)的影响；

图3(A)为单克隆抗体14624在食蟹猴血浆中对活化部分凝血活酶时间(aPTT)的影响，图3(B)为单克隆抗体14624在食蟹猴血浆中对凝血酶原时间(PT)的影响；

图4(A)为单克隆抗体14624在新西兰大白兔血浆中对活化部分凝血活酶时间(aPTT)的影响，图4(B)为单克隆抗体14624在新西兰大白兔血浆中对凝血酶原时间(PT)的影响；

图5(A)为FXIa与14624抗体的多循环动力学测试曲线，图5(B)为FXIa与N110D抗体的多循环动力学测试曲线；

图6为单克隆抗体14624抑制人FXIa水解S-2366的浓度-响应曲线；

图7为单克隆抗体14624对人FXIa介导的FIX活化反应的抑制作用；

图8为单克隆抗体14624、14627与抗原人PK、PKa、FXII、FXIIa、FIX、FIXa、FX、FXa、FVIIa和Thrombin的结合曲线；

图9为单克隆抗体14624对新西兰大白兔动静脉分流形成的血栓重量的抑制作用；

图10为单克隆抗体14624对新西兰大白兔动静脉分流血栓形成的抑制作用；

图11(A)为单克隆抗体14624对新西兰大白兔出血时间的影响，图11(B)为单克隆抗体14624对新西兰大白兔出血量的影响；

图12为单克隆抗体14624对新西兰大白兔活化部分凝血活酶时间(aPTT)的影响；

图13为单克隆抗体14624对新西兰大白兔凝血酶原时间(PT)的影响；

图14为单克隆抗体14624对新西兰大白兔血小板计数的影响。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1抗体分子筛选和构建

采用生物素标记人源天然噬菌体Fab库筛选的抗原FXIa和FXI(Enzyme ResearchLaboratories)，标记试剂盒为EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation kit(ThermoScientific,Cat.NO:21435)，使用Zeba的脱盐柱(Thermo Scientific,Cat.NO:89891)脱盐。

抗体的筛选策略为选取与FXIa结合但是不与FXI结合的Fab片段，经过筛选和测序得到20个独特性序列，通过PCR分别扩增重链可变区和轻链可变区序列，将其插入pcDNA3.3表达载体，转染CHO细胞，将培养细胞分泌的上清液进行纯化，得到全长的IgG1单克隆抗体14624，所述单克隆抗体14624的序列信息如SEQ ID NO:1-16所示。

作为阳性对照的克隆076D-M007-H04-CDRL3-N110D轻重链可变区序列来自于Bayer公司的美国专利US9783614B2，合成轻重链可变区序列后，同样插入到pcDNA3.3表达载体，转染CHO细胞，培养细胞分泌的上清液经过纯化，得到全长的IgG1单克隆抗体N110D，作为阳性对照抗体。

实施例2抗人FXIa全人源单克隆抗体14624的特异性功能验证

抗人FXIa全人源单克隆抗体14624与凝血因子FXIa或FXI的结合力通过ELISA进行检测。

结果如图1(A)和表1所示，本发明的14624单克隆抗体与FXIa结合力强，EC50为0.056nM，与阳性对照抗体N110D相当；如图1(B)所示，本发明的14624单克隆抗体不与FXI结合。

表1

抗体类型EC50(FXIa，nM)146240.056N110D0.11

实施例3活化部分凝血活酶时间(aPTT)和凝血酶原时间(PT)决定抗体在人血浆中的抗凝血活性

aPTT用于检测内源性和共同途径凝血因子的活性；PT用于检测外源性和共同途径凝血因子的活性。具体步骤如下：

取90μL标准人血浆(Dade Behring Diagnostics,Co.,Ltd.)和10μL不同浓度(0-8μM)的待测抗体混合，孵育5min，随后采用aPTT试剂盒和PT试剂盒(Dade BehringDiagnostics,Co.,Ltd.)在CA-600全自动血凝仪(Sysmex Ltd.)上进行分析检测。

如图2(A)和图2(B)所示，本发明的14624单克隆抗体可以增加活化部分凝血活酶时间(aPTT)，并在低浓度范围内呈现一定的浓度依赖性；但对凝血酶原时间(PT)无明显影响，说明单克隆抗体14624可以抑制人凝血的内源性途径，但并不影响外源性途径。

实施例4活化部分凝血活酶时间(aPTT)和凝血酶原时间(PT)检测抗体在非人血浆中的抗凝血活性

按照实施例3的方法，检测单克隆抗体14624在食蟹猴血浆(cyno plasma)和新西兰大白兔血浆(rabbit plasma)中的抗凝血活性。

如图3(A)和图3(B)所示，单克隆抗体14624在猴血浆中可以增加活化部分凝血活酶时间(aPTT)，并在低浓度范围内呈现一定的浓度依赖性；但对凝血酶原时间(PT)无明显影响；如图4(A)和图4(B)所示，单克隆抗体14624在兔血浆中同样可以增加活化部分凝血活酶时间(aPTT)，并在低浓度范围内呈现一定的浓度依赖性；但对凝血酶原时间(PT)无明显影响。表明单克隆抗体14624对食蟹猴和新西兰大白兔的FXIa有交叉反应。人、食蟹猴和新西兰大白兔血浆aPTT倍增所需浓度值如表2所示。

表2人、食蟹猴和新西兰大白兔aPTT倍增所需抗体浓度值

实施例5抗FXIa抗体对人FXIa的亲和力检测

本实施例利用BIAcore T200，通过表面等离子体共振(SPR)检测方法，实时定量检测FXIa与单克隆抗体14624之间的亲和力，评估抗FXIa抗体与FXIa的结合解离动力学特性。具体步骤如下：

(1)抗体的捕获：将待测抗体用1×PBS缓冲液稀释至1μg/mL，流速设置为10μL/min，Protein A芯片捕获抗体的时间为15s，分别捕获N110D抗体和14624抗体至Fc2和Fc4通道；

(2)样品测试条件：通过手动模式对FXIa与抗体的结合特性进行初步测定和评估，确定10nM作为FXIa的最高分析浓度，按照2倍梯度稀释，共设置10个分析浓度：0nM、0.01953nM、0.039625nM、0.078125nM、0.15625nM、0.3125nM、0.625nM、1.25nM、2.5nM、5nM和10nM，样品分析时设置流速为30μL/min，结合时间为120s，解离时间为600s；

(3)再生条件：参考其他实验，通过手动模式进行初步测定和评估，确定在ProteinA芯片分析待测抗体与FXIa的结合力时、采用Gly-HCl缓冲液(pH＝1.5)作为再生缓冲液，再生时流速设置为30μL/min，再生30s；

(4)动力学参数测定：实验采用多循环运行，其响应信号以分析时间为横坐标，响应值为纵坐标，所得数据通过BIAcore T200分析软件进行拟合，所采用的拟合模型为1:1Langmuir结合模型，确定结合速率常数、解离速率常数和结合解离常数等动力学常数。

被固定的14624抗体和N110D抗体与FXIa结合的SPR图谱如图5(A)和图5(B)所示，随着FXIa浓度的逐渐升高，抗体的响应逐渐增强。表3为抗体对FXIa的解离常数(KD)，由于当K_D≤10^-7M时即被认为高亲和力，所以N110D抗体和14624抗体与FXIa均具有高亲和力。

表3

抗体类型k_on(1/Ms)k_dis(1/s)K_D(M)146241.059E+80.0024512.314E-11N110D1.542E+80.0018891.225E-11

实施例6抗体功能性中和FXIa

本实施例利用FXIa酶切其特异性化学底物S-2366(Diapharma Inc.)，用酶标仪连续监测酶切产物的吸光度变化来确定人FXIa的活性。为了检测抗FXIa抗体的抑制活性，将FXIa用缓冲液(50mM HEPES(pH＝7.4)，145mM NaCl，5mM KCl，0.1％PEG8000，0.1％BSA)稀释到终浓度为2.5nM，与不同浓度的抗体在室温条件下孵育5min，随后在抗体抗原混合溶液中加入S-2366，使终浓度达到4mM，立即在SpetraMax 190酶标仪(Molecular DevicesInc.)上以动力模式每隔15s连续监测30min吸光度在405nm处的连续变化，所得数据采用GraphPad Prism软件进行分析。

结果如图6和表4所示，以抗体浓度的对数值为横坐标，酶反应速率为纵坐标作图，通过Graphpad Prism四参数方程拟合曲线得到IC50值，IC50表明抑制50％酶反应速率时的抗体浓度，IC50值越小，表明抗体的抑制活性越强，14624较N110D具有更强的抑制FXIa酶活的能力。

表4

实施例7抗体对FXIa介导的FIX转变为其活性形式FIXa的抑制作用

将终浓度为200nM的人FIX、终浓度5nM的人FXIa以及1μM的待测抗体在缓冲液(50mM HEPES(pH＝7.4)，145mM NaCl，5mM KCl，5mM CaCl₂，0.1％PEG>

如图7所示，与IgG1isotype对照相比，14624和阳性抗体N110D均能抑制FXI介导的FIXa生成。

实施例8抗体对FXIa的特异性抑制作用

本实施例采用ELISA分析凝血因子PK、PKa、FXII、FXIIa、FIX、FIXa、FX、FXa、FVIIa、Thrombin和系列浓度稀释的抗体结合能力。

如图8所示，待测抗体和阳性对照抗体与内源性外源性凝血通路上的其他凝血因子均无特异性结合。

实施例9抗体对新西兰兔动静脉旁路血栓形成的影响

将30只雄性新西兰兔根据体重随机分为5组，每组6只；给药剂量分别为生理盐水阴性对照组(IgG1isotype)10mg/kg、阳性对照组(N110D)1mg/kg、抗体低剂量组1mg/kg、抗体高剂量组3mg/kg；给药途径为耳缘静脉单次静脉推注。

所有动物在给药前(pre-perfusion)和给药后(post-perfusion)30min收集血样检测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(aPTT)和血小板计数(PLT)；所有新西兰兔颈部动静脉旁路血流形成2min后，在耳缘静脉相同位置处切一3mm的切口，记录动物出血时间和出血量；给药后30min，记录血栓湿重，并计算血栓形成抑制率。

采用统计学软件SPSS13.0对数据进行处理，计量资料以平均值±标准误来表示，具体分析过程如下：

采用Levene’s检验方差齐性，如果具有方差齐性(P>0.05)，则采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计分析；如果ANOVA有统计学意义(P≤0.05)，进一步使用LSDtest(参数法)进行比较分析；如果方差不齐(P≤0.05)，采用Kruskal-Wallis进行检验；如果Kruskal-Wallis检验有统计学意义(P≤0.05)，则进一步使用Mann-Whitney法进行均数间的两两比较。

如图9、图10、图11(A)和图11(B)所示，抗体低剂量组和高剂量组均能显著抑制动静脉分流血栓重量(thrombus weight)和血栓形成(thrombus inhibition)，但是不增加出血时间(bleeding time)和出血量(bleeding amount)。

如图12、图13和图14所示，与对照组相比，抗体低剂量组和高剂量组均能显著升高aPTT，但是不增加PT和血小板计数。

综上所述，本发明的14624单克隆抗体与FXIa结合力强，但是不与FXI结合，与FXIa具有高亲和力；14624单克隆抗体增加aPTT，但对PT无明显影响，具有抑制人凝血的内源性途径、但不影响外源性途径的作用；能够抑制FXI诱导的FIXa生成，对FXIa具有特异性抑制作用，对内源性外源性凝血通路上的其他凝血因子无特异性结合；能够显著抑制动静脉分流血栓形成，升高aPTT，具有成为抗血栓药物的潜能。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>上海博槿生物科技有限公司

<120>一种抗凝血因子XI活化形式因子XIa的抗体及其制备方法和应用

<130>20190808

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

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<213>人工合成

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Glu Leu Ser Met His

1 5

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<212>PRT

<213>人工合成

<400>2

Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

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Gly

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<212>PRT

<213>人工合成

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Asp Arg Pro Val Arg Gly Val Ile Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met

1 5 1015

Asp Val

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<212>PRT

<213>人工合成

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Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Arg Pro Val Asn

1 5 10

<210>5

<211>7

<212>PRT

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Ile Asp His Gln Arg Pro Ser

1 5

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<212>PRT

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Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asp Ala Tyr Val

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gaattatcca tgcac15

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ggttttgatc ctgaagatgg tgaaacaatc tacgcacaga agttccaggg c51

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<212>DNA

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gatcggccgg ttcggggagt tattccttac tactactact acggtatgga cgtc 54

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<212>DNA

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tctggaagcc gctccaacat cggaagtagg cctgtaaac39

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<400>11

attgatcatc agcggccctc a 21

<210>12

<211>33

<212>DNA

<213>人工合成

<400>12

gcagcatggg atgacagcct ggatgcttat gtc33

<210>13

<211>127

<212>PRT

<213>人工合成

<400>13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu

202530

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

354045

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

505560

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65707580

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Thr Asp Arg Pro Val Arg Gly Val Ile Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210>14

<211>110

<212>PRT

<213>人工合成

<400>14

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 1015

Thr Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Arg

202530

Pro Val Asn Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

354045

Ile Tyr Ile Asp His Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

505560

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65707580

Ser Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

859095

Asp Ala Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210>15

<211>381

<212>DNA

<213>人工合成

<400>15

caggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg tttccggata caccctcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct120

cctggaaaag ggcttgagtg gatgggaggt tttgatcctg aagatggtga aacaatctac180

gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacagcctac240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aacagatcgg300

ccggttcggg gagttattcc ttactactac tactacggta tggacgtctg gggccaaggg360

accctggtca ccgtctcgag c381

<210>16

<211>330

<212>DNA

<213>人工合成

<400>16

cagtctgccc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagac ggtcaccatc 60

tcttgctctg gaagccgctc caacatcgga agtaggcctg taaactggta ccagcacctc120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat attgatcatc agcggccctc aggggtccct180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag240

tctgacgatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgga tgcttatgtc300

ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta 330