一种含有机铬的预混料中喹乙醇的检测方法

摘要

本发明属于喹乙醇检测方法技术领域，具体涉及一种含有机铬的预混料中喹乙醇的检测方法。含有机铬的预混料中喹乙醇的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)样品的预处理向含有有机铬的预混料中先后加入弱碱水溶液和甲醇水溶液，超声处理、离心分离后得样品提取液；所述弱碱水溶液为碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾水溶液；(2)将所述样品提取液以382nm作为检测波长进行高效液相色谱分析。本发明提供的含有机铬的预混料中喹乙醇的检测方法，可以减少铬离子的干扰，同时将382nm作为检测波长，检测灵敏度提高，提高了检测结果准确性。

说明书

技术领域

本发明属于喹乙醇检测方法技术领域，具体涉及一种含有机铬的预混料中喹乙醇的检测方法。

背景技术

有机铬是一种常见的饲料添加剂，酵母铬、吡啶羧酸铬和烟酸铬是有机铬的常见形式，其中的三价铬可以增加胰岛素的活性，参与蛋白质的合成和核酸、脂肪的代谢，降低体内脂肪含量，促进畜禽降糖抑脂快速生长，提高饲料回报率，所以可按照限量要求添加到饲料中。

喹乙醇又称喹酰胺醇，被广泛用于畜禽饲料中起抗菌、促生长作用，但由于喹乙醇有中度至明显的蓄积毒性，对大多数动物有明显致畸作用，对人也有潜在的三致性，即致畸形，致突变，致癌。因此喹乙醇在美国和欧盟都被禁止用作饲料添加剂。《中国兽药典》(2005版)也有明确规定，喹乙醇被禁止用于家禽及水产养殖。所以喹乙醇的检测成为饲料产品是否合法合规的一项重要工作。

现有的检测饲料中喹乙醇的方法为国标GB/T 8381.7-2009《饲料中喹乙醇的测定高效液相色谱法》，该方法可用于检测一般饲料中的喹乙醇含量。但在日常检测工作中发现，当饲料中添加吡啶甲酸铬、生物铬等有机铬后，因有机铬与喹乙醇的保留时间极为相近，色谱峰几乎重叠，分离度<0.1，严重干扰喹乙醇的峰型而无法准确定量检测喹乙醇的含量，就会严重干扰喹乙醇检测的准确性，影响检测结果的判定。紫外可见光谱扫描(190-600nm)结果显示：喹乙醇、吡啶甲酸铬、生物铬在260nm附近都有强的吸收峰，在382nm附近却只有喹乙醇有吸收峰，吡啶甲酸铬、生物铬在此处没有紫外吸收信号峰，如果其它条件不变，直接将检测波长从260nm调整至382nm，含有机铬的预混料在382nm处的吸收强度较弱，响应低，检测灵敏度不高，检测结果和喹乙醇的实际含量仍存在一定偏差。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是旨在提供一种检测结果准确度高、操作简单的含有机铬的预混料中喹乙醇的检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了如下技术方案：一种含有机铬的预混料中喹乙醇的检测方法，其包括如下步骤：

(1)样品的预处理

向含有有机铬的预混料中先后加入弱碱水溶液和甲醇水溶液，超声处理、离心分离后得样品提取液；所述弱碱水溶液为NaHCO₃、Na₂CO₃、K₂CO₃或KHCO₃水溶液；

(2)试样测定

将所述样品提取液以382nm作为检测波长进行高效液相色谱分析。

优选地，步骤(1)中所述弱碱水溶液的浓度为5％-8％，甲醇水溶液的浓度为65％-80％；所述甲醇水溶液、NaHCO₃水溶液的体积比为80-95:20-5。

优选地，步骤(1)中所述弱碱水溶液和甲醇水溶液的体积之和与预混料的体积质量比为10-15mL/g。

优选地，步骤(1)所述的超声处理时温度为35-50℃，超声处理的时间为 30-50min。

优选地，进行步骤(2)所述的高效液相色谱分析时，采用如下分析条件：

色谱柱：C18填料的色谱柱；

流动相：体积浓度为40-60％、pH为4-5的乙腈水溶液为流动相A，体积浓度为15-30％的甲醇水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；

流速：0.5-1.0mL/min；

柱温：25-35℃。

优选地，步骤(2)所述的梯度洗脱的程序为：0min时，流动相B为100％； 10min时，流动相B为10％，流动相A为90％；15min时，流动相B为12％，流动相A为88％；20min时，流动相B为40％，流动相A为60％；25min时，流动相B为100％。

优选地，所述流动相A中加入0.1-2.0mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节pH 至4-5。

优选地，所述色谱柱填料的粒度为5.0μm，柱长250mm，内径4.6mm。

优选地，在进行步骤(2)之前还包括喹乙醇标准工作液的配制和标准曲线的绘制，配制得到的喹乙醇标准工作液的浓度为0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL。

进一步优选地，所述有机铬为吡啶甲酸铬或生物铬。

优选地，所述提取液在采用高效液相检测之前还进行如下净化处理：

将提取液加入活化好的固相萃取小柱SPE小柱，然后依次用0.01-0.04mol/L HCl溶液、三乙胺-柠檬酸混合溶液淋洗小柱，并将小柱吹干，最后用含有2-10％甲酸(v/v)的体积浓度为80-95％的甲醇水溶液洗脱；

所述三乙胺-柠檬酸混合溶液中三乙胺和柠檬酸的浓度为3％-8％:1％-3％。

采用本发明的提取液可以提高喹乙醇的提取效果，同时在高效液相分析过程中发现，相同条件下，喹乙醇在382nm处的吸收峰虽有所减弱，但是有机铬在 382nm处没有吸收峰，减少了有机铬的干扰，而且，试验结果表明，本发明的检测方法的检测结果与实际值基本一致。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的含有机铬的预混料中喹乙醇的检测方法，将382nm作为检测波长，避开了铬离子的干扰，提高了检测结果的准确性。

具体实施方式

下面对本发明做进一步说明，并给出本发明的实施例。本发明如下实施例中所述预混料除有机铬外还包括如下组分：复合维生素、复合微量元素、植酸酶、复合酶制剂、赖氨酸盐酸盐、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸、磷酸氢钙、石粉、谷糠载体；

所述复合维生素中包括如维生素维生素A、维生素D3、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素K3、烟酸/烟酰胺、D-泛酸钙、维生素B2、维生素B6、维生素B12、叶酸和D-生物素。

实施例1

一种含有机铬的预混料中喹乙醇的检测方法，其包括如下步骤：

(1)样品的预处理

取喹乙醇含量为8mg/kg的预混料5g(含吡啶甲酸铬100mg/kg)，先后加入浓度为5％的NaHCO₃水溶液5mL和浓度为65％的甲醇水溶液45mL，在40℃超声处理35min，离心分离后得样品提取液。

(1-1)标准曲线的绘制

配制如下浓度的喹乙醇的标准工作液0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1 μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL；标准工作液各进样20μL，进行高效液相分析，然后以峰面积为纵坐标，以喹乙醇的含量为横坐标，绘制标准曲线。

(2)试样测定

所述样品提取液在采用高效液相检测之前还进行如下净化处理：

将提取液加入活化好的SPE小柱，然后依次用0.02mol/L HCl溶液、三乙胺- 柠檬酸混合溶液淋洗小柱，并将小柱吹干，最后用含有3％甲酸的体积浓度为90％的甲醇水溶液洗脱得净化后的提取液；所述三乙胺-柠檬酸混合溶液中三乙胺与柠檬酸的浓度比为6％:2％；所述盐酸溶液、三乙胺-柠檬酸混合溶液、甲醇水溶液的用量均为10倍柱体积。

所述样品提取液在净化后采用如下条件进行高效液相色谱分析，其中，从标准曲线查得测定液中喹乙醇的含量：

色谱柱：C18填料的色谱柱(粒度为5.0μm，柱长250mm，内径4.6mm)；

流动相：体积浓度为40％、pH为4.2的乙腈水溶液为流动相A，体积浓度为 15％的甲醇水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；

流速：0.7mL/min；

柱温：35℃；

紫外检测器，检测波长，382nm；

进样体积：20μL；数据采集时间为25min。

所述高效液相色谱分析为梯度洗脱，梯度洗脱的程序为：0min时，流动相B 为100％；10min时，流动相B为10％，流动相A为90％；15min时，流动相B 为12％，流动相A为88％；20min时，流动相B为40％，流动相A为60％；25min 时，流动相B为100％。

采用如上检测方法测得喹乙醇含量为7.80mg/kg。

对照实验1

参照国标GB/T 8381.7-2009《饲料中喹乙醇的测定高效液相色谱法》对喹乙醇含量为8mg/kg的预混料5g(含吡啶甲酸铬100mg/kg)进行测定，具体操作如下：

试剂和溶液

除非另有规定，在分析中仅适用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682规定的三级用水。

1.1甲醇(色谱纯)。

1.2提取液：甲醇：水＝5：95。

1.3高效液相色谱流动相：甲醇和超纯水(采用二元梯度)。

1.4淋洗液1:0.02mol/L盐酸。移取1.67ml盐酸定容至1000ml。

1.5淋洗液2:0.1mol/L盐酸。移取8.33ml盐酸定容至1000ml。

1.6淋洗液3:甲醇：水＝5：95。

1.7洗脱液：甲醇：水＝40：60。

1.8喹乙醇标准储备液：准确移取喹乙醇乙醇标准品0.05020g(含量≥99.6％)，于50ml棕色容量瓶中，超声溶解，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，使其溶液浓度为1mg/ml。

1.9喹乙醇标准工作液：准确量取标准储备液(2.8)于容量瓶中，用洗脱液 (2.7)稀释，依次配制成浓度为0.1μg/ml、1.0μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml、 20.0μg/ml、50.0μg/ml、100.0μg/ml的标准溶液，现配现用。仪器

2.1离心机：3500r/min。

2.2摇床：转速可达110r/min。

2.3螺口离心管：50ml。

2.4超声波清洗器。

2.5微孔有机相滤膜：孔径0.2μm。

2.6固相萃取小柱(SPE)：Oasis HLB 1mL(30mg)。

2.7固相萃取仪。

2.8恒温振荡仪。

3试样制备

选取预混料样品500g，四分法浓缩至100g，磨碎，全部通过0.42mm孔径，混匀，装入密封容器中，避光低温保存，备用。

4分析步骤

4.1试液的制备

4.1.1提取

称取3g试样(准确至0.1mg)于具塞锥形瓶中，加入50mL提取液(1.2)，具塞置于摇床中，室温下恒温振荡器振荡速度110r/min，避光振荡45min。提取液在3500r/min下离心10min，上清液经滤纸过滤，滤液作为SPE小柱净化使用。

4.1.2净化

SPE小柱的活化：临用前分别向SPE小柱中加入2mL甲醇(1.1)和2mL 超纯水，对小柱进行活化。将滤液(4.1.1)2mL加入活化好的SPE小柱，分别用2mL淋洗液1(1.4)、淋洗液2(1.5)淋洗液3(1.6)淋洗小柱，并将小柱吹干。最后用2mL洗脱液(1.7)洗脱。

4.1.3上机

洗脱液过0.22um有机相滤膜，滤液上机测定。

4.2色谱条件

4.2.1色谱柱：具有C18填料的柱子(粒度为5μm)，柱长250mm，内径4.6mm。

4.2.2流动相及洗脱程序：如表1。

表1梯度洗脱程序

时间/min超纯水/％甲醇/％0851558515103070143070188515258515

4.2.3流速：1.00mL/min。

4.2.4进样体积：20μL。

4.2.5柱温：25℃。

4.2.6检测器：紫外检测器，检测波长260nm。

检测结果：所述预混料中喹乙醇的含量为12.73mg/kg。

对照试验2

采用同对照试验1的国标方法检测只含喹乙醇8mg/kg的预混料中喹乙醇的含量。

检测结果：所述预混料中喹乙醇的含量为7.88mg/kg。

对照试验3

采用同实施例1的检测方法检测只含喹乙醇8mg/kg的预混料中喹乙醇的含量。

检测结果：所述预混料中喹乙醇的含量为7.78mg/kg。

对照试验4

采用同对照试验1的国标方法检测只含吡啶甲酸铬100mg/kg，不含喹乙醇的预混料中喹乙醇的含量。

检测结果：所述预混料中喹乙醇的含量为4.85mg/kg。

对照试验5

采用同实施例1的检测方法检测只含吡啶甲酸铬100mg/kg，不含喹乙醇的预混料中喹乙醇的含量。

检测结果：所述预混料中喹乙醇的含量为0mg/kg。

对照试验6

该检测方法与对照试验1的区别仅在于，检测波长为382nm。

检测结果：所述预混料中喹乙醇的含量为6.75mg/kg。

加样回收率试验

表2加样回收率试验结果

对照品加样量mg/kg实际测量值mg/kg回收率％预混料8.07.8197.6预混料8.07.8698.3预混料8.07.7797.1预混料8.07.7496.8预混料8.07.7396.6

称取含有吡啶甲酸铬100mg/kg的预混料5g，共5份，分别加入0.04mg喹乙醇对照品(加标量为8mg/kg)，按实施例1的方法先对样品进行处理后进行测定。测得各对照品回收率，结果见表2。

由如上表2可以推知，如上样品的平均回收率为97.28％，RSD为0.45％。

实施例2

一种含有机铬的预混料中喹乙醇的检测方法，其包括如下步骤：

(1)样品的预处理

取喹乙醇含量为8mg/kg的预混料5g(含吡啶甲酸铬100mg/kg)，先后加入浓度为8％的NaHCO₃水溶液5mL和浓度为80％的甲醇水溶液45mL，在40℃超声处理35min，离心分离后得样品提取液。

(1-1)配制如下浓度的喹乙醇的标准工作液0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5 μg/mL、1μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL；采用如上标准工作液标绘制标准曲线。

(2)所述样品提取液采用如下条件进行高效液相色谱分析

所述样品提取液在采用高效液相检测之前还进行如下净化处理：

将提取液加入活化好的SPE小柱，然后依次用0.02mol/L HCl溶液、三乙胺 -柠檬酸混合溶液淋洗小柱，并将小柱吹干，最后用含有3％甲酸的体积浓度为 90％的甲醇水溶液洗脱得净化后的提取液；所述三乙胺-柠檬酸混合溶液中三乙胺与柠檬酸的浓度比为6％:2％；所述盐酸溶液、三乙胺-柠檬酸混合溶液、甲醇水溶液的用量均为10倍柱体积。

所述样品提取液在净化后采用如下条件进行高效液相色谱分析，其中，从标准曲线查得测定液中喹乙醇的含量；

色谱柱：C18填料的色谱柱(粒度为5.0μm，柱长250mm，内径4.6mm)；

流动相：体积浓度为50％、pH为4.2的乙腈水溶液为流动相A，

体积浓度为30％的甲醇水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；

流速：0.5mL/min；

柱温：25℃；

紫外检测器，检测波长，382nm；

进样体积:20μL；

数据采集时间为25min。

所述高效液相色谱分析为梯度洗脱，梯度洗脱的程序为：0min时，流动相B 为100％；10min时，流动相B为10％，流动相A为90％；15min时，流动相B 为12％，流动相A为88％；20min时，流动相B为40％，流动相A为60％；25min 时，流动相B为100％。

采用如上检测方法测得喹乙醇含量为8.20mg/kg。

实施例3

一种含有机铬的预混料中喹乙醇的检测方法，其包括如下步骤：

(1)样品的预处理

取喹乙醇含量为8mg/kg的预混料5g(含吡啶甲酸铬100mg/kg)，先后加入浓度为5％的NaHCO₃水溶液5mL和浓度为65％的甲醇水溶液45mL，在40℃超声处理35min，离心分离后得样品提取液。

(1-1)标准曲线的绘制

配制如下浓度的喹乙醇的标准工作液0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、 1μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL；标准工作液各进样20μL，进行高效液相分析，然后以峰面积为纵坐标，以喹乙醇的含量为横坐标，绘制标准曲线。

(2)试样测定

所述样品提取液采用如下条件进行高效液相色谱分析，

从标准曲线查得测定液中喹乙醇的含量：

色谱柱：C18填料的色谱柱(粒度为5.0μm，柱长250mm，内径4.6mm)；

流动相：体积浓度为40％、pH为4.2的乙腈水溶液为流动相A，体积浓度为15％的甲醇水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；

流速：0.7mL/min；

柱温：35℃；

紫外检测器，检测波长，382nm；

进样体积：20μL；数据采集时间为25min。

所述高效液相色谱分析为梯度洗脱，梯度洗脱的程序为：0min时，流动相B 为100％；10min时，流动相B为10％，流动相A为90％；15min时，流动相B 为12％，流动相A为88％；20min时，流动相B为40％，流动相A为60％；25min 时，流动相B为100％。

采用如上检测方法测得喹乙醇含量为8.18mg/kg。

实施例4

一种含有机铬的预混料中喹乙醇的检测方法，其与实施例1的区别在于，

(1)样品的预处理

取喹乙醇含量为8mg/kg的预混料5g(含吡啶甲酸铬100mg/kg)，先后加入浓度为20％的NaHCO₃水溶液20mL和浓度为65％的甲醇水溶液30mL，在40℃超声处理35min，离心分离后得样品提取液。

采用该检测方法测得喹乙醇含量为7.76mg/kg。

以上描述了本发明的基本原理和具体实施方式，但是本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明宗旨的前提下，本行业技术人员可以对其进行各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明要保护的范围内。