一种以四肽为功能配基的亲和仿生层析介质

摘要

本发明公开了一种以四肽为功能配基的亲和仿生层析介质，可用于抗体分离纯化，其四肽的氨基酸序列为苯丙氨酸—酪氨酸—色氨酸—精氨酸。采用烯丙基溴活化和溴代醇化，在多糖凝胶上连接空间臂己二胺，再偶联已乙酰化的苯丙氨酸—酪氨酸—色氨酸—精氨酸四肽配基，得到四肽层析介质。本发明的四肽层析介质，对抗体具有良好的吸附能力，且选择性高，可在弱碱性(pH 8.0)条件下吸附抗体，弱酸性(pH 5.0)条件下洗脱，分离条件温和，可用于从人血清中分离免疫球蛋白和细胞培养中分离单克隆抗体。

说明书

技术领域

本发明涉及一种以四肽为功能配基的亲和仿生层析介质，预计抗体分离纯化应用，属于生物化工领域中的蛋白层析分离技术。

背景技术

单克隆抗体(mAb)广泛应用于治疗癌症、自身免疫性疾病等。近年来，随着抗体工程发展，细胞表达水平显著提升，已高达10g/L。抗体药物纯度要求高，分离纯化工艺复杂，下游过程占生产成本的比重较大(50-80％)，研发经济高效的分离纯化新方法，已成为抗体制备领域的研究热点。

目前，最常用的抗体纯化技术为蛋白A亲和层析技术，其具有高选择性的优势。然而，蛋白A亲和介质价格昂贵，且存在配基易脱落、洗脱条件苛刻、配基脱落易引起免疫应答等不利因素。短肽仿生配基与蛋白配基相比，具有更加稳定、更小的免疫原性以及更廉价等优点，因此，得到抗体分离纯化领域的广泛关注。现今为止，已有诸多短肽配基被发现并成功应用于抗体分离纯化。Wang等(CN 104645949A；Biochemical EngineeringJournal.2016,114:191–201)设计和筛选得到四肽配基(酪氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-组氨酸)。此四肽介质可从含BSA的hIgG混合蛋白溶液中很好地分离纯化hIgG，此外，该四肽介质可很好地应用于CHO细胞中分离纯化单抗。但该配基需要通过添加盐离子屏蔽非特异性吸附，才能得到高纯度的抗体。Yao等(CN108905980A)利用分子模拟技术发明了一种以Ac-FYHE为功能配基的四肽层析介质。该介质可在中性条件下有效吸附抗体，且能在弱酸性条件下高效解离抗体，且可应用于从细胞培养上清液中分离单克隆抗体和人血清中分离hIgG。考虑酸性条件下分离纯化可能会引起蛋白的变性和聚集，故该四肽的分离条件需进一步优化。Menegatti等(Biotechnology and Bioengineering.2013,1175:249-258)通过mRNA展示和组合化学技术，设计出环状五肽配基库，筛选得到亲和性较强的环五肽[Link-M-WFRHY-K]。该环肽介质可很好地从工业CHO培养上清液中分离纯化IgG,而其分离条件偏酸性。考虑洗脱条件温和既能降低抗体变性的可能性，又能增加介质的稳定性，故而，再进一步实验中主要寻找性能更加优良的短肽配基，在提高吸附容量的同时使洗脱条件更为温和。

短肽亲和仿生介质主要由三部分组成，分别是基质、空间臂和短肽仿生配基。本发明设计四肽配基时，考虑常用的天然配基蛋白A和蛋白G中，起关键作用的残基包括苯丙氨酸，赖氨酸，色氨酸，组氨酸，精氨酸等(Journal of molecular recognition.2014,27:501-509)。为模拟天然配基的结构与功能，从文献报道关键氨基酸中任选四个随机组合，构成了四肽配基库。随后，通过计算机LibDock技术，计算配基库中四肽与Fc(PDB:1FC1)片段结合时的打分分数，筛选得到具有较高分数的四肽配基FYWR。之后研究中，将筛选得到的乙酰化的四肽配基(Ac-FYWR)接枝于以己二胺为空间臂的琼脂糖4FF上，制备得到四肽仿生介质，用于后续的分离纯化实验。

发明内容

本发明的目的是提供一种以氨基酸序列为苯丙氨酸—酪氨酸—色氨酸—精氨酸的四肽作为功能配基、多糖凝胶为基质、己二胺为空间臂的四肽亲和仿生层析介质，并应用于抗体分离纯化。

本发明首先提供了一种四肽亲和仿生层析介质，该介质包括层析基质、空间臂和配基，所述的层析基质为带有羟基的亲水性多糖凝胶，空间臂为己二胺，配基为氨基酸序列为苯丙氨酸—酪氨酸—色氨酸—精氨酸的四肽。

配基的分子结构为：

当配基偶联在层析基质的分子结构和组成为：

所述的层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性多糖凝胶。

作为优选，所述的层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。

所述的配基为苯丙氨酸(Phe，简写F)、酪氨酸(Tyr，简写Y、色氨酸(Trp，简写W)和精氨酸(Arg，简写R)组成的乙酰化后四肽Ac-FYWR。

本发明中四肽层析介质的结构式中只给出了一个配基基团，仅为示例性说明，实际基质表面和内部孔道表面均连接着大量的四肽配基基团。

本发明中层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性多糖凝胶，结构式如下：结构式就给出了一个羟基(—OH)，只是示例性说明，实际多糖凝胶的表面和内部孔道表面均具有大量的羟基(—OH)。

本发明还提供了一种上述四肽亲和仿生层析介质的制备方法：

包括如下步骤：

1)基质活化：层析基质用烯丙基溴进行活化处理，得到活化基质；

2)溴代醇化：活化基质用N-溴代丁二酰亚胺(NBS)进行溴代醇化，得到溴代基质；

3)空间臂偶联：将溴代基质与己二胺混合，在碳酸钠缓冲液中进行反应，得到氨基活化基质；

4)配基偶联：氨基活化基质依次用去离子水、50％乙醇、无水乙醇和无水N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤。随后依次加入四肽配基、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、抽干介质和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。水浴摇床中反应，得到四肽介质。最后将四肽介质依次用无水DMF、无水乙醇、50％乙醇和去离子水清洗，抽滤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，水浴摇床中反应，随后去离子水洗涤，得到四肽亲和仿生层析介质。

作为优选的，所述步骤1)的基质活化步骤具体为：在反应容器中依次加入氢氧化钠、20％(v/v)二甲基亚砜溶液、层析基质、烯丙基溴，摇床中活化，抽滤，去离子水洗涤，抽滤，得到活化基质。

进一步优选的，100mL锥形瓶中，依次加入5g NaOH和10mL 20％(v/v)二甲基亚砜溶液，待液体冷却后，加入抽干的层析基质10g，最后加入10mL烯丙基溴，30℃下180rpm摇床中活化24h。

作为优选的，所述步骤2)的溴代醇化步骤具体为：将活化后基质与NBS混合，进行溴代醇化，摇床中反应，去离子水洗涤，抽滤，得到溴代基质。

进一步优选的，将10g层析基质活化得到的活化基质与5g NBS混合进行溴代醇化，30℃下180rpm摇床中反应3h，用去离子水洗涤，抽滤后得到溴代基质。

作为优选的，所述步骤3)的空间臂偶联步骤具体为：将溴代基质、己二胺和碳酸钠缓冲液(pH 12)混合，摇床中反应，得到氨基活化基质。

进一步优选的，将10g层析基质经活化、溴代醇化后得到的溴代基质和3mL己二胺以及1M碳酸钠缓冲液(pH 12)混合，30℃下180rpm摇床中反应24h，得到氨基活化基质。

作为优选的，所述步骤4)的配基偶联步骤具体为：将氨基活化基质加入到含四肽、HATU和DIPEA的DMF中，其中四者的比例为四肽:DMF:HATU:DIPEA＝1:1:2:4.25℃下水浴摇床中反应8小时，得到四肽介质。然后将介质依次用无水DMF,50％乙醇，无水乙醇和去离子水清洗，抽滤。最后，将抽干介质加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下水浴摇床中反应1h，去除残余氨基，随后去离子水洗涤，得到四肽亲和仿生层析介质。

本发明还提供了一种四肽配基，其分子结构式如下：

该配基为借助计算机分子模拟的手段，对蛋白A和抗体结合位点进行分析评估，设计筛选而得，其为苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和精氨酸(Arg)组成的四肽。

本发明还提供了一种所述的四肽亲和仿生层析介质在抗体分离中的应用。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明的四肽亲和仿生层析介质对抗体亲和力高，吸附容量大，静态吸附容量达到110mg/g介质以上，10％动态吸附载量达到26mg/mL介质以上。

(2)本发明的四肽层析介质可在pH 8.0吸附抗体，pH 5.0洗脱，洗脱条件温和，避免过酸条件下抗体聚集或者活性下降。

(3)本发明的四肽层析介质对抗体的吸附选择性较强，可达到抗体分离纯化目的。

附图说明

图1为实施例5中四肽亲和仿生层析介质在pH 5.0～8.0条件下对hIgG的吸附等温线。

图2为实施例6中四肽亲和仿生层析介质在pH 5.0～8.0条件下对hIgG的穿透曲线。

图3为实施例7中四肽亲和仿生层析介质在CHO中分离mAb的SEC-HPLC分析图。

图4为实施例7中四肽亲和仿生层析介质在CHO中分离mAb的还原SDS-PAGE分析图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明作进一步的说明：

实施例1：四肽亲和层析介质的制备

以琼脂糖凝胶为基质制备四肽层析介质的过程主要包括基质活化、溴代醇化、空间臂偶联和配基偶联4个步骤。(1)基质活化：先称取5g氢氧化钠，加入10mL 20％(v/v)DMSO溶液，溶解，静置，待溶液冷却后，加入抽干的10g琼脂糖凝胶基质，随后加入10mL烯丙基溴，30℃下180rpm摇床中活化24h，去离子水洗涤，抽滤，得到活化基质；(2)溴代醇化：将活化基质与5g NBS混合，30℃下180rpm摇床中反应3小时，用去离子水洗涤，抽滤，得到溴代基质；(3)空间臂偶联：将溴代基质和3mL己二胺以及1M碳酸钠缓冲液(pH 12)混合，30℃下180rpm摇床中反应24h，0.1M HCl、0.1M NaOH、去离子水依次洗涤，抽滤，得到氨基活化基质；(4)四肽配基偶联：取1g氨基活化基质，依次用去离子水、50％乙醇、无水乙醇和无水DMF洗涤，抽滤。随后在100mL锥形瓶中加入100mg四肽和5mL DMF，混匀，依次加入95mg2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和、1g抽干氨基活化介质和87μL N,N-二异丙基乙胺，25℃下水浴摇床中反应8小时，依次用无水DMF、无水乙醇、50％乙醇和去离子水清洗介质，抽滤，得到四肽介质。最后，将抽干介质加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下水浴摇床中反应1小时，再用去离子水洗涤，得到以四肽亲和仿生层析介质，配基密度为115μmol/g介质。

实施例2：四肽亲和层析介质的制备

以琼脂糖凝胶为基质制备四肽层析介质的过程主要包括基质活化、溴代醇化、空间臂偶联和配基偶联4个步骤。(1)基质活化：先称取5g氢氧化钠，加入10mL 20％(v/v)DMSO溶液，溶解，静置，待溶液冷却后，加入抽干的10g琼脂糖凝胶基质，随后加入10mL烯丙基溴，30℃下180rpm摇床中活化24h，去离子水洗涤，抽滤，得到活化基质；(2)溴代醇化：将活化基质与5g NBS混合，30℃下180rpm摇床中反应3小时，用去离子水洗涤，抽滤，得到溴代基质；(3)空间臂偶联：将溴代基质和3mL己二胺以及1M碳酸钠缓冲液(pH 12)混合，30℃下180rpm摇床中反应24h，0.1M HCl、0.1M NaOH、去离子水依次洗涤，抽滤，得到氨基活化基质；(4)四肽配基偶联：取1g氨基活化基质，依次用去离子水、50％乙醇、无水乙醇和无水DMF洗涤，抽滤。随后在100mL锥形瓶中加入60mg四肽和5mL DMF，混匀，依次加入95mg2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和、1g抽干氨基活化介质和87μL N,N-二异丙基乙胺，25℃下水浴摇床中反应8小时，依次用无水DMF、无水乙醇、50％乙醇和去离子水清洗介质，抽滤，得到四肽介质。最后，将抽干介质加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下水浴摇床中反应1小时，再用去离子水洗涤，得到以四肽亲和仿生层析介质，配基密度为97μmol/g介质。

实施例3：四肽亲和层析介质的制备

以琼脂糖凝胶为基质制备四肽层析介质的过程主要包括基质活化、溴代醇化、空间臂偶联和配基偶联4个步骤。(1)基质活化：先称取5g氢氧化钠，加入10mL 20％(v/v)DMSO溶液，溶解，静置，待溶液冷却后，加入抽干的10g琼脂糖凝胶基质，随后加入10mL烯丙基溴，30℃下180rpm摇床中活化24h，去离子水洗涤，抽滤，得到活化基质；(2)溴代醇化：将活化基质与5g NBS混合，30℃下180rpm摇床中反应3小时，用去离子水洗涤，抽滤，得到溴代基质；(3)空间臂偶联：将溴代基质和3mL己二胺以及1M碳酸钠缓冲液(pH 12)混合，30℃下180rpm摇床中反应24h，0.1M HCl、0.1M NaOH、去离子水依次洗涤，抽滤，得到氨基活化基质；(4)四肽配基偶联：取1g氨基活化基质，依次用去离子水、50％乙醇、无水乙醇和无水DMF洗涤，抽滤。随后在100mL锥形瓶中加入40mg四肽和5mL DMF，混匀，依次加入95mg2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和、1g抽干氨基活化介质和87μL N,N-二异丙基乙胺，25℃下水浴摇床中反应8小时，依次用无水DMF、无水乙醇、50％乙醇和去离子水清洗介质，抽滤，得到四肽介质。最后，将抽干介质加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下水浴摇床中反应1小时，再用去离子水洗涤，得到以四肽亲和仿生层析介质，配基密度为67μmol/g介质。

实施例4：四肽亲和层析介质的制备

以琼脂糖凝胶为基质制备四肽层析介质的过程主要包括基质活化、溴代醇化、空间臂偶联和配基偶联4个步骤。(1)基质活化：先称取5g氢氧化钠，加入10mL 20％(v/v)DMSO溶液，溶解，静置，待溶液冷却后，加入抽干的10g琼脂糖凝胶基质，随后加入10mL烯丙基溴，30℃下180rpm摇床中活化24h，去离子水洗涤，抽滤，得到活化基质；(2)溴代醇化：将活化基质与5g NBS混合，30℃下180rpm摇床中反应3小时，用去离子水洗涤，抽滤，得到溴代基质；(3)空间臂偶联：将溴代基质和3mL己二胺以及1M碳酸钠缓冲液(pH 12)混合，30℃下180rpm摇床中反应24h，0.1M HCl、0.1M NaOH、去离子水依次洗涤，抽滤，得到氨基活化基质；(4)四肽配基偶联：取1g氨基活化基质，依次用去离子水、50％乙醇、无水乙醇和无水DMF洗涤，抽滤。随后在100mL锥形瓶中加入20mg四肽和5mL DMF，混匀，依次加入95mg2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和、1g抽干氨基活化介质和87μL N,N-二异丙基乙胺，25℃下水浴摇床中反应8小时，依次用无水DMF、无水乙醇、50％乙醇和去离子水清洗介质，抽滤，得到四肽介质。最后，将抽干介质加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下水浴摇床中反应1小时，再用去离子水洗涤，得到以四肽亲和仿生层析介质，配基密度为39μmol/g介质。

实施例5：四肽层析介质的静态吸附性能

取实施例1所得到的层析介质，考察不同pH条件下，该介质吸附人免疫球蛋白hIgG的静态吸附性。首先用去离子水充分清洗介质，抽干。随后，分别准确称取0.03g介质于2mL离心管中，加入0.8mL不同浓度的hIgG缓冲溶液；将离心管置于恒温混匀仪中，25℃下1200rpm吸附3小时。达到吸附平衡后，离心分离，取出上清液测定hIgG的浓度。最后，根据物料平衡计算介质的吸附容量，绘制吸附等温线，并根据Langmuir方程拟合得到饱和吸附容量和解离常数。如附图1所示，在pH 8.0条件时，介质吸附hIgG能力最佳，饱和吸附容量为110.7mg/g介质，解离常数为0.10mg/mL。而在pH 5.0条件下，介质吸附hIgG能力极弱。本发明的四肽仿生层析介质可在pH 8.0条件下吸附hIgG，且吸附量较大，随后在pH 5.0条件下洗脱。

实施例6：四肽层析介质的动态吸附性能

取适量实施例1所得到的层析介质装填到Tricorn 5/50层析柱中，进样前先用缓冲溶液平衡层析柱(pH 5.0，醋酸盐缓冲液；pH 6.0-8.0，磷酸盐缓冲液)。配制2mg/mL的人免疫球蛋白(hIgG)溶液，调节pH至缓冲液pH。以0.5mL/min流速上样，至蛋白穿透50％以上停止上样。紫外检测器在波长280nm下实时监测层析柱出口处穿透液的蛋白浓度变化，绘制穿透曲线，结果如附图2所示。上样结束后，先使用平衡缓冲液冲洗，再依次用20mM pH 4.0醋酸盐缓冲液洗脱，0.1M NaOH溶液再生，最后使用平衡缓冲液重新平衡。依据蛋白10％穿透时的上样体积，计算10％穿透时的动态附载量，pH 8.0时，hIgG的10％动态载量为26.7mg/ml；pH 5.0时，hIgG的10％动态载量为1.0mg/ml。本发明的四肽层析介质对抗体具有良好的吸附选择性，可通过pH 8.0吸附，pH 5.0洗脱达到抗体的分离纯化目的。pH 5.0的洗脱条件比现有技术中优化后的最佳pH 4.5的洗脱条件更温和，本发明进一步优化的洗脱条件，既能降低蛋白变性的可能性，又能增加介质的稳定性，具有显著的技术效果。

实施例7：四肽层析介质的分离性能

取适量实施例1所得到的层析介质填装于Tricorn 5/50层析柱中，约1mL。使用平衡缓冲液(20mM pH 8.0磷酸盐缓冲液)预平衡层析介质，约12倍柱体积(CV)。再以0.5mL/min流速将CHO细胞培养上清液(mAb浓度约为0.9mg/mL)上样，上样体积为2mL。上样完成后，以0.5mL/min流速淋洗。然后以0.5mL/min流速进行洗脱，洗脱缓冲液为20mM pH 5醋酸盐缓冲液。之后再以pH 4.0进行二次洗脱。最后，使用0.1M NaOH溶液以0.3mL/min流速对层析介质进行清洗再生，然后用平衡缓冲液重新平衡层析介质。通过上样、淋洗、洗脱、二次洗脱和再生五个阶段的流出液进行收集，并将收集的组分进行SEC-HPLC和还原型SDS-PAGE分析，结果如附图3与图4所示，pH 5.0洗脱分离得到单抗的纯度为97.34％，收率为77.76％。