以四肽为配基的仿生层析介质的制备与吸附分离抗体性能研究

摘要

目前，蛋白A亲和层析被普遍应用于抗体捕获，但该方法存在如配基脱落、价格昂贵等缺陷，一定程度上制约了该技术的规模化应用。多肽仿生层析技术作为一种潜在的蛋白A亲和层析替代方法，具有成本低、洗脱温和、耐酶解等优点，受到了广泛的关注。本文基于实验和计算机辅助方法，分析四肽仿生介质与抗体或杂蛋白间的相互作用，设计和筛选新型四肽仿生配基，探讨四肽仿生层析介质分离抗体的新工艺。
　　首先将课题组前期筛选得到的5个四肽仿生配基（Ac-HYRF，Ac-HWRH，Ac-YHRI，Ac-FHRA，Ac-FYRH）通过空间臂偶联于琼脂糖凝胶基质上，考察这5种四肽介质对抗体的吸附性能。静态吸附实验表明，5种四肽介质对于人免疫球白蛋白(hIgG)和牛血清白蛋白(BSA)均具有较好的结合能力。经过进一步实验发现介质对BSA的吸附几乎完全依赖静电相互作用，而对于hIgG的结合则是由疏水相互作用和静电相互作用共同主导。另外，四肽介质Ac-FYRH-4FF对于含BSA的抗体料液，分离效果不理想，需要进一步的改进配基以提升分离效率。
　　为提高四肽介质对抗体的吸附选择性，本文分别引入组氨酸、半胱氨酸和色氨酸替代精氨酸，设计出3个新型四肽配基Ac-FYCH、Ac-FYWH、Ac-FYHE。分子对接、静态/动态吸附和混合蛋白料液分离实验表明，Ac-FYHE配基对于hIgG具有较高的结合能力和吸附选择性。在pH7.0条件下Ac-FYHE-4FF对hIgG的动态载量(Q10％)为24.1 mg/mL，而对于BSA仅只有2.1 mg/mL。从hIgG和BSA的混合蛋白料液中分离hIgG，得到纯度和收率分别达到93.4％和92.1％。
　　最后，深入考察了Ac-FYHE-4FF介质的吸附性能。结果表明，配基密度越高，抗体的吸附量越大，但配基的吸附效率有所下降。添加0.5 MNaCl，吸附量下降低于20％。而添加50％乙二醇，吸附量下降70％左右，说明疏水相互作用主导了Ac-FYHE-4FF介质与hIgG之间的结合。以hIgG和BSA模型蛋白，确定在pH7.5和pH3.5～5.0分别为抗体最佳的上样和洗脱条件。进一步将Ac-FYHE-4FF层析柱应用于从CHO细胞培养上清液以及人血清中一步分离单抗mAb或hIgG，得到抗体纯度和收率均大于90％。显示了Ac-FYHE-4FF介质分离纯化抗体的应用潜力。
　　本文围绕四肽仿生层析，设计并筛选到对于抗体具有较高吸附选择性的新型四肽配基Ac-FYHE，并成功应用于抗体初步分离，有助于多肽仿生层析方法在抗体分离纯化过程中的推广和应用。

目录

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论文说明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 抗体

1．2．1 抗体的结构

1．2．2 抗体的应用

1．3 抗体分离纯化方法

1．3．1 非层析法

1．3．2 层析法

1．4 多肽仿生层析

1．4．1 多肽仿生层析的原理

1．4．2 多肽仿生配基的设计

1．4．3 多肽仿生配基的筛选

1．4．4 多肽仿生配基在抗体分离中应用

1．5 本文的研究思路

第二章 以Ac-NH-Aro-Aro-R-Aro／Ali-COOH为配基模型的四肽介质性能考察

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 试剂与仪器

2．2．2 四肽介质制备

2．2．3 己二胺偶联密度测定

2．2．4 四肽配基偶联密度测定

2．2．5 蛋白Zeta电位测定

2．2．6 吸附等温线测定

2．2．7 动态载量测定

2．2．9 Ac-FYRH-4FF层析介质的分离性能

2．2．11 还原SDS-PAGE分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 四肽配基结构式及性质

2．3．2 氨基密度和四肽偶联密度测定

2．3．3 蛋白zeta电位

2．3．4 吸附等温线

2．3．6 Ac-FYRH-4FF层析柱中抗体的洗脱

2．3．7 Ac-FYRH-4FF层析柱的分离性能

2．4 本章小结

第三章 新型四肽配基的设计及筛选

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 试剂与仪器

3．2．2 分子对接

3．2．3 介质制备

3．2．4 吸附等温线测定

3．2．5 动态载量测定

3．2．6 混合蛋白料液分离hIgG

3．3．1 四肽配基及Fc-A片段分子结构

3．3．2 分子对接

3．3．3 吸附等温线

3．3．4 动态载量

3．3．5 混合蛋白中分离hIgG

3．4 本章小结

第四章 以FYHE为配基的四肽介质吸附和分离性能考察

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 试剂与仪器

4．2．2 四肽介质制备

4．2．3 吸附等温线

4．2．4 吸附动力学测定

4．2．5 动态载量

4．2．6 层析介质中抗体的吸附

4．2．7 层析介质中抗体的洗脱

4．3 结果讨论

4．3．1 配基密度的影响

4．3．2 NaCl和乙二醇对吸附的影响

4．3．3 吸附动力学曲线

4．3．4 动态载量

4．3．5 上样条件优化

4．3．6 洗脱条件优化

4．3．7 Ac-FYHE-4FF层析介质的分离性能

4．4 本章小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

作者简介