用于汞离子检测的金纳米带适体传感器的制备及检测方法

摘要

本发明公开了一种用于汞离子检测的金纳米带适体传感器的制备及检测方法。用硫醇基团修饰的富含T的适体通过Au‑S共价键自组装到工作电极上，在Hg

说明书

技术领域

本发明涉及传感器件制备技术，尤其涉及一种用于汞离子检测的金纳米带适体传感器的制备及检测方法。

背景技术

目前中国由于在重金属的开采、冶炼、加工过程中，造成不少重金属如铅、汞、镉、钴等进入大气、水、土壤引起严重的环境污染。如随废水排出的重金属，即使浓度小，也可在藻类和底泥中积累，被鱼和贝类体表吸附，产生食物链浓缩，从而造成公害。世界卫生组织WHO要求饮用水中二价汞离子含量含有不超过30nM。在农村或偏远地区使用实验室技术进行汞检测可能导致样品丢失和污染。因此，为了实现环境监测和随后的污染控制，对快速，简单，小型化，高选择性和灵敏的汞离子检测平台有了极大的需求。目前，报道了许多用于Hg²⁺检测的方法，例如光谱技术，电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)和电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)。但这些方法通常很耗时，需要进行样品预处理和复杂操作。因此一种简单，灵敏，经济的检测方法对于Hg²⁺的检测和监控非常必要。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于汞离子检测的金纳米带适体传感器的制备及检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于汞离子检测的金纳米带适体传感器的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)加工金纳米带传感器，具体包括以下子步骤：

(1.1)选用玻璃作为基底，经过RCA标准清洗工艺清洗并烘干；

(1.2)在基底上依次溅射TiW粘附层、金电极层及银电极层，金电极层的厚度为100nm；

(1.3)通过光刻法分别刻蚀出银参比电极、银对电极和金工作电极；

(1.4)使用PECVD沉积Si₃N₄绝缘层，作为传感器的绝缘层；

(1.5)在Si₃N₄绝缘层上光刻出银参比电极和银对电极的电极图形；

(1.6)使用硅刀进行切割，此时在切面处暴露出纳米级的金工作电极；

(1.7)从焊盘引金线压焊于PCB板并用环氧树脂密封完成传感器封装，得到金纳米带传感器。

(2)在金纳米带传感器上修饰适体，具体包括以下子步骤：

(2.1)将2μl 100μM适体(5’-SH-(CH₂)₆-TTT>

(2.2)通过TCEP溶液将MCH溶液稀释至2mM，得到MCH-TCEP溶液。

(2.3)将2μl MCH-TCEP溶液加入到制备的适体-TCEP溶液中，得到混合物，然后通过含有0.1M NaCl的0.01M PBS(pH 7.4)将混合物稀释至300μl。

(2.4)将金纳米带传感器在4℃下浸没在稀释后的混合物中8小时。

(2.5)用10mM Tris-HCl彻底冲洗金纳米带传感器以除去非特异性吸附在工作电极上的适体，得到用于汞离子检测的金纳米带适体传感器。

进一步地，所述步骤(1.3)具体包括以下子步骤：

(a)在电极上旋涂光刻胶，经紫外曝光显影，采用湿法腐蚀，通过对应掩膜版刻蚀出银参比电极；

(b)清洗多余光刻胶，再次在电极上旋涂光刻胶，经紫外曝光显影，采用湿法腐蚀，通过对应掩膜版刻蚀出银对电极和金工作电极。

一种利用金纳米带适体传感器检测汞离子的方法，该方法包括以下步骤：

(1)制备不同浓度的Hg²⁺标准溶液，将金纳米带适体传感器浸入汞液中，在25℃下进行胸腺嘧啶-Hg²⁺-胸腺嘧啶(T-Hg²⁺-T)配对，放置20min后，对用PBS缓冲液清洗后的金纳米带适体传感器进行EIS扫描，通过EIS仿真得到阻抗值并绘制线性曲线，线性关系式为ΔR/R₀＝-0.1314log[C]+1.423，C是Hg²⁺浓度，R₀是金纳米带适体传感器工作电极的电子转移阻抗，ΔR是每次加入Hg²⁺后所得到的电子转移阻抗R_CT与R₀的差值。

(2)将金纳米带适体传感器浸入待检测饮用水中，在25℃下进行胸腺嘧啶-Hg²⁺-胸腺嘧啶(T-Hg²⁺-T)配对，放置20min后，对用PBS缓冲液清洗后的金纳米带适体传感器进行EIS扫描，得到R_CT和R₀，输入到步骤(1)建立的线性关系式中，得到待检测饮用水的Hg²⁺浓度。

进一步地，将金纳米带适体传感器的工作电极、外接参考电极(Ag/AgCl电极)、外接对电极(Pt电极)插入到电化学池中，以2mM>3[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]作为底液进行EIS表征。

本发明的有益效果：

1、金纳米带传感器含有金纳米带工作电极，宽度为100nm。该纳米级工作电极提高了Hg²⁺的传质速率和检测灵敏度。

2、金纳米带传感器具有成本低、易于操作的优点，并且当性能大幅下降后可通过切割边缘再生。

3、适体修饰后的金纳米带传感器降低了Hg²⁺检出限，在水环境中实际样品的痕量Hg²⁺检测具有十分大的潜力。

附图说明

图1(a)是在基底上依次溅射TiW粘附层、金电极层及银电极层；

图1(b)在图1(a)基础上通过对应掩膜版刻蚀出银参比电极；

图1(c)在图1(b)基础上通过对应掩膜版刻蚀出金工作电极；

图1(d)在图1(c)基础上沉积Si₃N₄绝缘层；

图1(e)在图1(d)基础上光刻出银参比电极和银对电极的电极图形；

图2是纳米带电极截面SEM；

图3是本发明电化学适体传感器的制备图；

图4是本发明电化学适体传感器过程中每步处理后的电化学阻抗谱曲线；

图5是本发明电化学适体传感器检测不同浓度Hg²⁺的电化学阻抗谱曲线；

图6是本发明电化学适体传感器分别与不同浓度的Hg²⁺反应后电子传递阻抗变化率与Hg²⁺浓度之间的对数关系；

图7是本发明电化学适体传感器在不同物质干扰下的阻抗变化结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明基于T-Hg²⁺-T配位化学结构开发了一种无标记的电化学金纳米带适体传感器，可用于饮用水中的Hg²⁺检测。用硫醇基团修饰的富含T的适体通过Au-S共价键自组装到工作电极上，在Hg²⁺存在下，适体将捕获Hg²⁺，从而诱导从单链到双链样结构的构象变化，促进电子转移。电化学阻抗谱(EIS)用于检测Hg²⁺介导的构象变化。通过优化实验条件，此传感器的线性范围为0.1nM至1μM，检测限为40pM(8ppt)。

本发明提出的一种用于汞离子检测的金纳米带适体传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)加工金纳米带传感器：金纳米带传感器的制备流程如图1(a)-图1(e)所示，具体如下：

(1.1)选用玻璃作为基底，经过RCA标准清洗工艺清洗并烘干；

(1.2)在基底上依次溅射TiW粘附层、金电极层及银电极层(如图1(a))，金电极层的厚度为100nm；

(1.3)通过光刻法分别刻蚀出银参比电极、银对电极和金工作电极；具体包括以下子步骤：

(a)在电极上旋涂光刻胶，经紫外曝光显影，采用湿法腐蚀，通过对应掩膜版刻蚀出银参比电极(如图1(b))；

(b)清洗多余光刻胶，再次在电极上旋涂光刻胶，经紫外曝光显影，采用湿法腐蚀，通过对应掩膜版刻蚀出银对电极和金工作电极(如图1(c))；

(1.4)使用PECVD沉积Si₃N₄绝缘层，作为传感器的绝缘层(如图1(d))；

(1.5)在Si₃N₄绝缘层上光刻出银参比电极和银对电极的电极图形(如图1(e))；

(1.6)使用硅刀进行切割，此时在切面处暴露出纳米级的金工作电极；

(1.7)从焊盘引金线压焊于PCB板并用环氧树脂密封完成传感器封装，得到金纳米带传感器。

为了验证传感器Au金属层的结构与尺寸，使用TEM进行表征，如图2所示。

(2)在金纳米带传感器上修饰适体，过程如图3所示：

(2.1)将2μl 100μM适体(5’-SH-(CH₂)₆-TTT>

(2.2)通过TCEP溶液将MCH溶液稀释至2mM，得到MCH-TCEP溶液。

(2.3)将2μl MCH-TCEP溶液加入到制备的适体-TCEP溶液中，得到混合物，然后通过含有0.1M NaCl的0.01M PBS(pH 7.4)将混合物稀释至300μl。

(2.4)将金纳米带传感器在4℃下浸没在稀释后的混合物中8小时。

(2.5)用10mM Tris-HCl彻底冲洗金纳米带传感器三次以除去非特异性吸附在工作电极上的适体，得到用于汞离子检测的金纳米带适体传感器。

对适体修饰前的金工作电极、适体修饰后的金工作电极、以及加Hg²⁺后的金工作电极分别进行电化学阻抗表征。将金纳米带适体传感器的工作电极、外接参考电极(Ag/AgCl电极)、外接对电极(Pt电极)插入到电化学池中，以2mM>3[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆](0.1MKCl配)作为底液进行EIS表征。如图4所示(其中横坐标为阻抗的实部值，纵坐标为阻抗的虚部值)。电子转移阻抗(R_CT)反映了电子从[Fe(CN)₆]^3-/4-转移到工作电极上的难度。适体修饰前的电极(图4中的a曲线)的R_CT为1.18kΩ，是最小的。由于适体中的磷酸基团上的负电荷增加了电极表面上的负电荷，阻碍了电子转移和[Fe(CN)₆]^3-/4-的扩散，当工作电极上修饰适体后，传感器的R_CT增加到11.21kΩ(图4中的b曲线)。在Hg²⁺加入后，R_CT降低至10.01kΩ。阻抗的降低表明工作电极表面的负电荷随着T-Hg²⁺-T的增加而减小。Hg²⁺诱导的适体构象变化促进电子转移，随着Hg²⁺的加入，R_CT降低(图4中的c曲线)。

利用金纳米带适体传感器检测Hg²⁺的具体实施方式如下：

(1)制备不同浓度的Hg²⁺标准溶液(浓度范围0mM-2μM)，将金纳米带适体传感器浸入汞液中，在25℃下进行胸腺嘧啶-Hg²⁺-胸腺嘧啶(T-Hg²⁺-T)配对，放置20min后，对用PBS缓冲液清洗后的金纳米带适体传感器进行EIS扫描。如图5所示(其中横坐标为阻抗的实部值，纵坐标为阻抗的虚部值)，随着汞离子的增多，阻抗谱半径不断减小，通过EIS仿真得到阻抗值并绘制线性曲线，如图6所示。线性关系式为ΔR/R₀＝-0.1314log[C]+1.423，线性度为0.994，C是Hg²⁺浓度，R₀是金纳米带适体传感器工作电极的电子转移阻抗，ΔR是每次加入Hg²⁺后所得到的电子转移阻抗R_CT与R₀的差值。

(2)将金纳米带适体传感器浸入待检测饮用水中，在25℃下进行胸腺嘧啶-Hg²⁺-胸腺嘧啶(T-Hg²⁺-T)配对，放置20min后，对用PBS缓冲液清洗后的金纳米带适体传感器进行EIS扫描，得到R_CT和R₀，输入到步骤(1)建立的线性关系式中，得到待检测饮用水的Hg²⁺浓度。

同时，为了验证传感器的特异性，将传感器置于其他重金属溶液中，同样条件下，进行EIS扫描，没有明显变化，如图7所示，说明本发明电化学适体传感器的特异性强。

需要声明的是，本发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。