在可降解吸收金属基层表面构建有机-无机杂化功能涂层的方法

摘要

本发明公开了一种在可降解吸收金属基层表面构建有机‑无机杂化功能涂层的方法，属于生物材料表面改性领域。本发明通过在锌基可降解金属基底表面构建杂化涂层，解决现有的技术中的涂层对基底的腐蚀降解控制不足及生物相容性欠缺的问题，达到同时兼顾对基底的降解调控并提高其生物相容性的双重目的。

说明书

技术领域

本发明属于生物材料表面改性领域，具体涉及一种在可降解吸收金属基层表面构建有机-无机杂化功能涂层的方法。

背景技术

可降解金属材料兼具传统金属材料良好的力学性能以及可被人体组织吸收、代谢的特性，有望成为新一代“革命性”的生物医用材料。可降解金属中的锌基金属因其自身特点，理论上可拥有较为理想的体内降解速度，所以正逐渐受到研究者们的关注。然而锌基金属基底的不均匀腐蚀会导致局部锌离子浓度过高并产生细胞毒性，从而影响了材料的生物相容性，这是将锌基金属应用于生物医用材料领域所面临的巨大挑战。针对于此，通过表面改性在锌基金属表面构建涂层是解决上述问题的有效手段。

目前将锌基金属应用于生物医用材料领域的表面改性研究仍较为缺乏，其中所涉及的技术包括：1)通过机械提拉法，在锌丝表面包覆高分子涂层；2)利用微弧氧化，在纯锌基底表面制备无机涂层。现有的技术中，采用机械提拉法制备的高分子涂层与金属基底的结合力不足，而且在制备涂层前，需要使用化学试剂对基底进行预处理。此外，高分子涂层的酸性降解产物可能会诱发炎症反应。经过微弧氧化处理制备的无机涂层，会加速基底的腐蚀降解速率，可能导致锌离子的突释，从而产生潜在的细胞毒性。

发明内容

本发明的目的在于：本发明提供一种在可降解吸收金属基层表面构建有机-无机杂化功能涂层的方法，通过在可降解金属基底表面构建杂化涂层，以解决现有的技术中的涂层对基底的腐蚀降解控制不足及生物相容性欠缺的问题，达到同时兼顾对基底的腐蚀降解调控并提高其生物相容性的双重目的。

本发明采用的技术方案如下：

一种在可降解吸收金属基层表面构建有机-无机杂化功能涂层的方法，包括以下步骤：

S1.将可降解吸收金属基层打磨至光滑平整，抛光、清洗并干燥；

S2.在40-55℃条件下将步骤S1所得的金属基层置于无机磷酸溶液中浸泡3-5min，得到表面覆盖无机涂层的金属基层；

S3.在40-55℃条件下将表面覆盖无机涂层的金属基层在浓度为0.05-0.20mol/L的有机双膦酸溶液中浸泡25-35min；

S4.重复S2、S3步骤3-7次，清洗并干燥，即得。

本发明的机理是：通过在金属表面预先构建稳定的无机磷酸缓冲涂层，随后有机双膦酸分子，如阿伦膦酸，与无机磷酸盐之间发生化学作用并吸附于无机磷酸盐涂层。进一步地，无机磷酸表面的阿伦膦酸分子与溶液中的金属离子之间通过配位作用相互结合，被固定的金属离子作为形核位点，诱导无机磷酸盐生成，从而在金属表面制备出有机-无机杂化功能化涂层。

进一步地，S2步骤中无机磷酸溶液的配制方法为：首先配制浓度为0.03-0.05mol/L的Zn(NO₃)₂溶液和浓度为0.15-0.30mol/L的Na₂HPO₄溶液，然后将两种溶液以0.8-1.2:1的比例混合制得；当溶液中的Zn²⁺和PO₄^3-到达饱和，不可溶的磷酸晶体在锌金属表面沉积，并最终生长成为无机磷酸涂层。制备方法可采用其他可提供Zn²⁺和PO₄^3-的试剂，如ZnO、Zn(OOCCH₃)₂和H₃PO₄、NH₄H₂PO₄；溶液中的硝酸根离子可促进无机磷酸涂层的沉积速率，并可以使得涂层的更均匀、致密，从而提高涂层的抗腐蚀能力。

进一步地，S2步骤中无机磷酸溶液的配制方法为：首先配制浓度为0.04mol/L的Zn(NO₃)₂溶液和浓度为0.20mol/L的Na₂HPO₄溶液，然后将两种溶液以1:1的比例混合制得。

进一步地，还包括用NaOH溶液将无机磷酸溶液的pH值调至3-4。

进一步地，S3步骤中有机双膦酸溶液为阿伦膦酸溶液；阿伦膦酸，是有机小分子，可以与无机磷酸涂层发生化学反应从而吸附于涂层表面，可以和金属离子发生配位作用，被螯合固定金属离子作为形核位点，诱导无机磷酸盐生长。还可起到促进成骨细胞生长的作用，从而提高涂层的生物相容性。

进一步地，S3步骤还包括用NaOH溶液将有机双膦酸混合液的pH值调至3-4。

进一步地，S4步骤中将浸泡后的金属基层用水清洗3-5次，然后自然干燥。

进一步地，S1步骤中用350-2000目的砂纸对金属基层进行打磨，打磨后的金属基层分别用水和无水乙醇进行超声清洗各5次，每次5分钟。

进一步地，将清洗后的金属基层真空干燥，金属基层平整洁净的表面有利于形成均匀的涂层，并可提高涂层与基底的结合力。

进一步地，金属基层为锌基层或铁基层或镁基层或锌基合金基层或镁基合金基层或铁基合金基层。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、本发明中，对金属基层进行预处理，打磨抛光并清洗干燥，平整洁净的表面有利于形成均匀的涂层，并可提高涂层与金属基层的结合力；

2、本发明的无机磷酸溶液，通过将含有Zn²⁺和PO₄^3-的溶液进行混合，当溶液中的Zn²⁺和PO₄^3-到达饱和，不可溶的磷酸晶体在金属表面沉积，并最终生长成为无机磷酸涂层；

3、本发明所用的有机双膦酸，即阿伦膦酸，是一种生物安全的有机小分子，可与锌离子发生配位螯合，被螯合固定金属离子作为形核位点，诱导无机磷酸盐生长，形成稳定结构涂层；此外，阿伦膦酸还具有促进成骨细胞粘附、增殖的能力，因而，本发明所构建的杂化涂层可促进成骨细胞生长，具有良好的生物相容性；

4、本发明的有机—无机杂化涂层通过在溶液中交替沉积的方法构建，所需温度为40-55℃；反应温度过低，如室温以下，反应活性不足，不利于涂层在金属基层表面沉积；温度过高，如80℃以上，会导致溶液酸性上升，同样会抑制无机磷酸涂层的形成；本发明中的最佳反应温度为50℃，反应条件温和，涂层的构建工艺方便简单；

5、本发明所构建的杂化涂层致密、均匀，对锌基金属基层的腐蚀降解可起到较好的控制作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例样品的扫描电镜图；

图2为Zn金属片的扫描电镜图；

图3为Zn金属片和本发明实施例样品表面的化学成分红外光谱图；

图4为Zn金属片和本发明实施例样品表面的N元素高分辨XPS谱图；

图5为Zn金属片和本发明实施例样品的极化曲线图；

图6为成骨细胞粘附图；

图7为成骨细胞粘附数量统计图；

图8为培养1、3天后的成骨细胞粘附图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本发明较佳实施例提供的一种在可降解吸收金属基层表面构建有机-无机杂化功能涂层的方法，其步骤如下：

S1.将锌金属片用砂纸打磨、抛光，在分别用去离子水及无水乙醇进行超声清洗，然后真空干燥；

S2.配制浓度为0.03mol/L的Zn(NO₃)₂溶液和浓度为0.15mol/L的Na₂HPO₄溶液，然后将两种溶液以1.0:1的比例混合，配制成无机混合溶液，并用NaOH溶液将无机混合液的pH值调至3.2；

S3.另配制浓度为0.08mol/L的阿伦膦酸溶液，并用NaOH溶液将阿伦膦酸溶液的pH值调至3.2；

S4.经步骤S1处理后的锌金属片置于S2步骤的无机混合液中浸泡，40℃条件下浸泡5min，得到表面覆盖无机涂层的锌金属片；

S5.将表面覆盖无机涂层的锌金属片在S3步骤的阿伦膦酸溶液中浸泡，40℃条件下浸泡35min；

S6.依次循环重复S4、S5两步骤4次后将锌金属片清洗、干燥，从而在锌金属表面构建出有机-无机杂化功能涂层。

实施例2

本发明较佳实施例提供的一种在可降解吸收金属基层表面构建有机-无机杂化功能涂层的方法，其步骤如下：

S1.将锌金属片用砂纸打磨、抛光，在分别用去离子水及无水乙醇进行超声清洗，然后真空干燥；

S2.配制浓度为0.05mol/L的Zn(NO₃)₂溶液和浓度为0.18mol/L的Na₂HPO₄溶液，然后将两种溶液以1.2:1的比例混合，配制成无机混合溶液，并用NaOH溶液将无机混合液的pH值调至3.8；

S3.另配制浓度为0.10mol/L的阿伦膦酸溶液，并用NaOH溶液将阿伦膦酸溶液的pH值调至3.8；

S4.经步骤S1处理后的锌金属片置于S2步骤的无机混合液中浸泡，42℃条件下浸泡5min，得到表面覆盖无机涂层的锌金属片；

S5.将表面覆盖无机涂层的锌金属片在S3步骤的阿伦膦酸溶液中浸泡，42℃条件下浸泡35min；

S6.依次循环重复S4、S5两步骤3次后将锌金属片清洗、干燥，从而在锌金属表面构建出有机-无机杂化功能涂层。

实施例3

本发明较佳实施例提供的一种在可降解吸收金属基层表面构建有机-无机杂化功能涂层的方法，其步骤如下：

S1.将锌金属片用砂纸打磨、抛光，在分别用去离子水及无水乙醇进行超声清洗，然后真空干燥；

S2.配制浓度为0.04mol/L的Zn(NO₃)₂溶液和浓度为0.20mol/L的Na₂HPO₄溶液，然后将两种溶液以1.1:1的比例混合，配制成无机混合溶液，并用NaOH溶液将无机混合液的pH值调至3.5；

S3.另配制浓度为0.13mol/L的阿伦膦酸溶液，并用NaOH溶液将阿伦膦酸溶液的pH值调至3.5；

S4.经步骤S1处理后的锌金属片置于S2步骤的无机混合液中浸泡，45℃条件下浸泡4min，得到表面覆盖无机涂层的锌金属片；

S5.将表面覆盖无机涂层的锌金属片在S3步骤的阿伦膦酸溶液中浸泡，45℃条件下浸泡30min；

S6.依次循环重复S4、S5两步骤5次后将锌金属片清洗、干燥，从而在锌金属表面构建出有机-无机杂化功能涂层。

实施例4

本发明较佳实施例提供的一种在可降解吸收金属基层表面构建有机-无机杂化功能涂层的方法，其步骤如下：

S1.将锌金属片用砂纸打磨、抛光，在分别用去离子水及无水乙醇进行超声清洗，然后真空干燥；

S2.配制浓度为0.04mol/L的Zn(NO₃)₂溶液和浓度为0.24mol/L的Na₂HPO₄溶液，然后将两种溶液以1.0:1的比例混合，配制成无机混合溶液，并用NaOH溶液将无机混合液的pH值调至4.0；

S3.另配制浓度为0.16mol/L的阿伦膦酸溶液，并用NaOH溶液将阿伦膦酸溶液的pH值调至4.0；

S4.经步骤S1处理后的锌金属片置于S2步骤的无机混合液中浸泡，48℃条件下浸泡4min，得到表面覆盖无机涂层的锌金属片；

S5.将表面覆盖无机涂层的锌金属片在S3步骤的阿伦膦酸溶液中浸泡，48℃条件下浸泡30min；

S6.依次循环重复S4、S5两步骤7次后将锌金属片清洗、干燥，从而在锌金属表面构建出有机-无机杂化功能涂层。

实施例5

本发明较佳实施例提供的一种在可降解吸收金属基层表面构建有机-无机杂化功能涂层的方法，其步骤如下：

S1.将锌金属片用砂纸打磨、抛光，在分别用去离子水及无水乙醇进行超声清洗，然后真空干燥；

S2.配制浓度为0.036mol/L的Zn(NO₃)₂溶液和浓度为0.27mol/L的Na₂HPO₄溶液，然后将两种溶液以1.0:1的比例混合，配制成无机混合溶液，并用NaOH溶液将无机混合液的pH值调至3.0；

S3.另配制浓度为0.20mol/L的阿伦膦酸溶液，并用NaOH溶液将阿伦膦酸溶液的pH值调至3.0；

S4.经步骤S1处理后的锌金属片置于S2步骤的无机混合液中浸泡，50℃条件下浸泡3min，得到表面覆盖无机涂层的锌金属片；

S5.将表面覆盖无机涂层的锌金属片在S3步骤的阿伦膦酸溶液中浸泡，50℃条件下浸泡28min；

S6.依次循环重复S4、S5两步骤6次后将锌金属片清洗、干燥，从而在锌金属表面构建出有机-无机杂化功能涂层。

实施例6

本发明较佳实施例提供的一种在可降解吸收金属基层表面构建有机-无机杂化功能涂层的方法，其步骤如下：

S1.将锌金属片用砂纸打磨、抛光，在分别用去离子水及无水乙醇进行超声清洗，然后真空干燥；

S2.配制浓度为0.048mol/L的Zn(NO₃)₂溶液和浓度为0.30mol/L的Na₂HPO₄溶液，然后将两种溶液以0.9:1的比例混合，配制成无机混合溶液，并用NaOH溶液将无机混合液的pH值调至3.5；

S3.另配制浓度为0.20mol/L的阿伦膦酸溶液，并用NaOH溶液将阿伦膦酸溶液的pH值调至3.5；

S4.经步骤S1处理后的锌金属片置于S2步骤的无机混合液中浸泡，55℃条件下浸泡3min，得到表面覆盖无机涂层的锌金属片；

S5.将表面覆盖无机涂层的锌金属片在S3步骤的阿伦膦酸溶液中浸泡，55℃条件下浸泡25min；

S6.依次循环重复S4、S5两步骤3次后将锌金属片清洗、干燥，从而在锌金属表面构建出有机-无机杂化功能涂层。

实验例1

分别对Zn金属片和实施例1制备得到的样品(记为Zn-PCC@AL)进行扫描电镜测试，观察样品表面形貌，如图1、图2所示。

从图中可看出，Zn表面存在大量机械打磨后留下的划痕。而经本发明的方法改性后的样品的表面则覆盖了一层均匀、致密的涂层。

实验例2

对Zn金属片和实施例2制备得到的样品进行红外光谱分析实验，检测表面化学成分组成，得到结果如图3所示。

经过红外光谱分析可知，相比于Zn金属片，经过本发明的方法改性过后的样品在950cm^-1及1060cm^-1处出现P-OH和P＝O的吸收峰，并且在1386cm^-1及1500cm^-1处观测到与阿伦膦酸相关的-OH和-NH₂红外特征峰，由此表明有机-无机杂化涂层的成功构建。

实验例3

对Zn金属片和实施例3制备得到的样品进行X射线光电子能谱测试，分析样品表面化学成分及结合状态，其结果如图4所示。

Zn金属片表面并未检测到N元素的相关特征峰。而经过本发明的方法改性过后的样品表面可以观察到阿伦膦酸所特有的-NH₂的特征峰，这证明了样品表面成功构建了有机-无机杂化功能涂层。此外，还可看到了新的C-N-Zn特征峰，以此可知阿伦膦酸与锌离子之间发生了配位作用。

实验例4

对Zn金属片和实施例4制备得到的样品进行极化曲线的测定，得到结果如图5所示。

从动电位极化曲线可看出，相比于Zn，本发明的方法制备得到的样品的自腐蚀电位升高且自腐蚀电流密度更小，其抗腐蚀能力有所提升，这表明杂化涂层可起到调控金属基底的腐蚀降解的效果。

实验例5

考察Zn金属片和实施例1-6制得的样品的生物相容性。

本实验例待细胞培养瓶内的成骨细胞生长之铺满瓶底约80％后，可进行细胞消化及接种。本实施例所用的成骨细胞购买于武汉塞维尔生物科技有限公司。成骨细胞培养使用的培养基为添加10％胎牛血清的α-MEM(赛默飞世尔仪器有限公司，苏州)培养基。成骨细胞的接种步骤如下：

实验器材灭菌处理，将经过灭菌处理离心管、镊子、玻璃吸管和蓝色枪头，移液枪提前放入细胞实验台中紫外辐照半小时以上；将细胞培养瓶内的培养基倒出，用生理盐水清洗三次，吸出剩余生理盐水，防止残余的生理盐水稀释胰酶浓度，降低消化效果；用吸管将含有EDTA的胰酶均匀滴加到培养瓶内，保证胰酶与细胞完全接触，拧紧培养瓶瓶盖，放于显微镜下观察，若细胞形态已经皱缩变圆并发亮，且可看到部分细胞漂浮，则加入培养基终止消化，并用玻璃吸管将培养基中漂浮的细胞吹散均匀；将吹打均匀的细胞悬液加入离心管中，离心5min，1200rpm/min；离心结束后，倒出离心管中的培养基，加入新的培养基，将离心管底部的细胞重新吹打均匀；将1mL细胞悬液加入到细胞计数板进行计数；将样品的两面紫外辐照各半小时后，放入24孔板中，每孔1个样品；移液枪将稀释好的细胞悬液缓慢滴加到置于24孔板内的样品表面，每孔滴加1mL，随后将24孔板放入细胞孵箱中进行培养，孵箱的环境为37℃，5％CO₂。

本实验例利用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行染色，从而检测成骨细胞在样品表面的粘附数量，并用罗丹明对细胞骨架进行染色，从而观察成骨细胞在样品表面的形态。细胞染色后，将样品置于荧光显微镜下进行观察分析。染色步骤如下：细胞培养4小时、12小时以及1天、3天后，吸出24孔板内的培养基，用生理盐水缓慢清洗样品三遍，加入5％戊二醛溶液固定24小时；吸出戊二醛，用生理盐水清洗样品三遍；在避光条件下每个样品表面滴加80μL DAPI，反应5min，用生理盐水清洗样品三遍，吹干；在避光条件下每个样品表面滴加80μL罗丹明，反应10min，用生理盐水清洗样品三遍，吹干；避光保存样品。

从图6、图7的成骨细胞粘附图及粘附数量统计可知，本发明的方法制得的样品表面粘附的细胞数量均明显高于Zn。而从图8可以看到，经过1天及3天的培养之后，Zn表面的细胞呈现皱缩的圆球状，而本发明的方法制得的样品表面的细胞铺展形态良好，且细胞数量有所增加。由此可知有机-无机磷酸复合涂层可促进成骨细胞粘附及增殖，涂层具有较好的生物相容性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。