三维聚球培养腔模具和癌细胞化疗药物浓度的筛选方法

摘要

本发明提供一种三维聚球培养腔模具和癌细胞化疗药物浓度的筛选方法，其中，所述三维聚球培养腔模具包括至少一个用于通过倒模制作细胞培养孔的模具柱，所述模具柱包括沿其倒模时的插置方向依次同轴连接的第一节段、第二节段和半球体，第一节段的轴向长度为半球体半径的20‑30倍，第二节段的轴向长度为半球体半径的10‑15倍，第二节段包括至少两段层叠设置的缓冲节段，所述缓冲节段的侧壁均沿插置方向朝向模具柱的轴线倾斜设置且倾斜角度不同。本发明提供的三维聚球培养腔模具可在现有的孔板上通过倒模制作模拟人体环境的细胞培养孔，实现高效的三维细胞培养。此外，缓冲节段可使细胞培养孔对应形成具有多层缓冲结构的缓冲腔，避免在更换液体时破坏细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种三维聚球培养腔模具及采用所述三维聚球培养腔模具的癌细胞化疗药物浓度的筛选方法。

背景技术

肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，因此肝癌的治疗有着十分重要的意义以及影响。大部分肝癌患者存在肝功能障碍，对全身系统化疗耐受程度低，并且肝癌细胞对多数传统化疗药物有耐药性。因此针对每位肝癌患者选择最敏感的抗癌药物能有效减少患者对化疗药物的接触，并且有利于提高疾病治疗效果。

在培养癌细胞的过程中，传统的二维细胞培养方法为细胞生长在单层的玻璃或塑料平面上,具有较好的伸展性,但难以模拟体内真实的情况。同时由于培养器皿的结构，在培养过程中容易受到流体扰动的影响，导致所培养的细胞受损损伤甚至死亡。而一般的三维细胞培养方法需要专门制作模拟体内环境的细胞培养孔，制作成本高且无法重复使用。

发明内容

本发明的首要目的旨在提供一种可重复制作三维细胞培养孔的三维聚球培养腔模具。

本发明的另一目的在于提供一种采用所述三维聚球培养腔模具的癌细胞化疗药物浓度的筛选方法。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种三维聚球培养腔模具，包括至少一个用于通过倒模制作细胞培养孔的模具柱，所述模具柱包括沿其倒模时的插置方向依次同轴连接的第一节段、第二节段和半球体，所述第一节段的轴向长度为所述半球体半径的20-30倍，所述第二节段的轴向长度为所述半球体半径的10-15倍，所述第二节段包括至少两段沿所述插置方向层叠设置的缓冲节段，至少两段所述缓冲节段的侧壁均沿所述插置方向朝向所述模具柱的轴线倾斜设置且倾斜角度不同。

优选地，沿所述插置方向，每段所述缓冲节段的侧壁与所述轴线的夹角依次减小。

优选地，所述第一节段包括与所述第二节段连接的定位节段，所述定位节段的侧壁沿所述插置方向朝向所述轴线倾斜设置。

更优地，所述定位节段的母线的延长线与所述缓冲节段的侧壁相交。

优选地，所述第一节段还包括与所述定位节段远离所述第二节段的一端连接的第一连接节段，所述第一连接节段为底面半径小于或等于0.6mm的圆柱体。

进一步地，所述第二节段还包括两端分别抵接所述缓冲节段和定位节段的第二连接节段。

进一步地，所述第二节段还包括两端分别抵接所述缓冲节段和半球体的第三连接节段。

优选地，所述三维聚球培养腔模具由光敏树脂材料一体成型。

优选地，所述三维聚球培养腔模具包括连接板和至少两个排列设于所述连接板上的所述模具柱，所述模具柱通过所述第一节段与所述连接板连接。

进一步地，至少两个所述模具柱等距排列，相邻两个模具柱的轴线的间距为9mm-30mm。

作为第二方面，本发明还提供一种癌细胞化疗药物浓度的筛选方法，其特征在于，采用上述三维聚球培养腔模具，所述筛选方法包括如下步骤：配置三维聚球培养腔模具和孔板，将所述三维聚球培养腔模具在孔板上通过倒模操作形成细胞培养孔；取用原代分离的细胞悬液接种于所述细胞培养孔中进行三维聚球培养，以形成细胞三维聚球；所述细胞三维聚球达到试验要求之后，向所述细胞培养孔中加入预设浓度梯度的待测药物；与所述待测药物共同培养预定时间后，测定细胞活性指标，以确定针对所述细胞化疗药物及该化疗药物的敏感浓度。

进一步地，将所述三维聚球培养腔模具在孔板上通过倒模操作形成细胞培养孔，具体包括：获取琼脂糖溶液，将琼脂糖溶液加热至透明状后加入所述孔板内；将所述三维聚球培养腔模具沿其轴向竖直插置于所述孔板内，且所述半球体位于底部；待琼脂糖溶液冷凝形成细胞培养孔后，取出所述三维聚球培养腔模具。

优选地，将所述三维聚球培养腔模具在孔板上通过倒模操作形成细胞培养孔之前，还包括：采用紫外线照射对所述三维聚球培养腔模具进行消毒。

优选地，取用原代分离的细胞悬液接种于所述细胞培养孔中进行三维聚球培养之前，还包括：采用细胞培养基对所述细胞培养孔进行湿润处理。

优选地，所述细胞培养孔包括对应所述第一节段形成的换液腔；在取用原代分离的细胞悬液接种于所述细胞培养孔中进行三维聚球培养步骤中，包括：采用移液枪抵靠所述换液腔的侧壁更换细胞培养液。

更优地，向所述细胞培养孔中加入预设浓度梯度的待测药物，具体为：采用移液枪抵靠所述换液腔的侧壁向所述细胞培养孔中加入预设浓度梯度的待测药物。

相比现有技术，本发明的方案具有以下优点：

1.本发明提供的三维聚球培养腔模具可在现有的细胞培养板上通过倒模制作细胞培养孔，实现高效的三维细胞培养，且所述三维聚球培养腔模具可在经过消毒后重复使用，根据需求制作多个细胞培养孔，从而在提高细胞培养成功率及有效性的同时，降低细胞培养的成本，且能够满足设置对照组、空白组、重复实验复孔的要求。

2.本发明提供的三维细胞培养模具中，第二节段包括至少两段层叠设置且侧壁倾斜的缓冲节段，细胞培养孔对应所述缓冲节段形成多层倾斜设置的缓冲腔，即所述缓冲腔具有多层用于减弱液体流动力的导流结构，避免在细胞培养更换液体时由于液体剪切力影响细胞的生长。

3.本发明提供的三维细胞培养模具中，第一节段包括其侧壁倾斜设置的定位节段，细胞培养孔可对应所述定位节段形成具有斜面的换液平台，便于移液枪抵接更换液体，相比竖直结构可进一步减弱液体的流动力，保护细胞。此外，具有斜面结构的换液平台还可起到定位液体高度的作用，进而可控制每次吸取和添加的液体数量，实现预定更换液体的比例，便于使用者操作。

4.本发明提供的癌细胞化疗药物浓度的筛选方法，采用所述三维细胞培养模具，能较高程度地模拟供体体内状态，在更换液体时较好地保护细胞，可针对不同的供体筛选药物并提供药敏图谱，结果可靠，筛选周期短，能够满足临床需求。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为本发明提供的三维细胞培养模具的主视图；

图2为图1所示的三维细胞培养模具中的模具柱的主视图；

图3为图1所示的三维细胞培养模具倒模制成的细胞培养孔的剖视图；

图4为本发明提供的癌细胞化疗药物浓度的筛选方法的步骤图；

图5为本发明提供的癌细胞化疗药物浓度的筛选方法培养出的细胞球的显微放大图；

图6为本发明提供的癌细胞化疗药物浓度的筛选方法与普通二维培养方法中，多柔比星药物浓度与肝癌细胞抑制率的曲线图；

图7为本发明提供的癌细胞化疗药物浓度的筛选方法与普通二维培养方法中，索拉菲尼药物浓度与肝癌细胞抑制率的曲线图；

图8为本发明提供的癌细胞化疗药物浓度的筛选方法与普通二维培养方法中，顺铂+5-Fu药物浓度与肝癌细胞抑制率的曲线图；

图9为本发明提供的癌细胞化疗药物浓度的筛选方法与普通二维培养方法中，奥沙+5-Fu药物浓度与肝癌细胞抑制率的曲线图；

图10为本发明提供的癌细胞化疗药物浓度的筛选方法与普通二维培养方法对比的药敏图谱。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。

本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、零/部件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、零/部件、组件和/或它们的组。应该理解，当我们称零/部件被“连接”到另一零/部件时，它可以直接连接到其他零/部件，或者也可以存在中间零/部件。这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的全部或任一单元和全部组合。

如图1所示，本发明实施例提供一种三维细胞培养模具1，包括连接板11和等距排列于所述连接板11上的多个模具柱12，所述模具柱12用于通过倒模制作可模拟人体环境的细胞培养孔2(在图3中示出)，通过所述细胞培养孔2实现高效的三维细胞培养，提高细胞培养成功率及有效性的同时，降低细胞培养的成本。

在本实施例中，所述连接板11上排列设有六个所述模具柱12，可在孔板3上倒模同时形成六个所述细胞培养孔2。在使用过程中如需制作多组所述细胞培养孔2，可灵活应用多个所述三维细胞培养模具1，例如采用十二个所述三维细胞培养模具1在96孔板上制作十二排细胞培养孔2，满足设置对照组、空白组、重复实验复孔等实验需求。相应地，相邻两个模具柱12之间的间距根据孔板的孔距设置。本实施例中，为适配96孔板，相邻两个模具柱12的轴线的间距为9mm。在其它施方式中，本领域技术人员可根据实际需求调整所述模具柱12的数量和间距，例如采用不同规格的孔板时，相邻两个模具柱12的轴线的间距可在9mm-30mm之间进行调整。此外，还可根据需求在一个三维细胞培养模具1中设有多排所述模具柱12。

请结合图2和图3，所述模具柱12包括沿其倒模时的插置方向依次同轴连接的第一节段121、第二节段122和半球体123。相应地，所述细胞培养孔2一一对应形成换液腔21、缓冲腔22和半球形的培养腔23，所述培养腔23用于收容培养的细胞。所述第一节段121和第二节段122由多个同轴连接的圆柱体和圆台体组合形成，从而可对应所述换液腔21和缓冲腔22形成多层倾斜设置的导流结构，减弱在细胞培养更换液体时液体的冲击力，避免由于液体流动产生的剪切力影响所述培养腔23内细胞的生长。

应当理解的是，在其他实施方式中，第一节段121和第二节段122还可由层叠设置的多个多棱柱和多棱台组合而成，同样可形成多层倾斜设置的导流结构。

在本实施例中，所述模具柱12的轴向长度为10.55mm，小于所述孔板3的孔深，即所述模具柱12在插置于所述孔板3内时，通过所述连接板11抵接所述孔板3的上表面可使所述半球体123不接触所述孔板3的底部，以更好地适配所述孔板3进行倒模操作，形成完整的细胞培养孔2。

具体地，所述第一节段121的轴向长度为7mm，所述第二节段122的轴向长度为3.3mm，所述半球体123的半径为0.25mm，上述轴向长度等同于所述细胞培养孔2的孔深，从而分别限定所述换液腔21、缓冲腔22和培养腔23的容积。值得注意的是，本领域技术人员可通过调整各个节段的长度来改变所述细胞培养孔2内各个腔体的容积，以适应不同的实验需求。优选地，所述第一节段121的轴向长度为所述半球体123半径的20-30倍，所述第二节段122的轴向长度为所述半球体123半径的10-15倍，保证所述换液腔21和缓冲腔22具有足够储液和缓冲空间，从而给所述培养腔23提供较好的培养环境，保护所述培养腔23内的细胞。

在图2中示出，所述第二节段122包括三段沿所述插置方向层叠设置的缓冲节段1221，三段所述缓冲节段1221的侧壁均沿所述插置方向朝向所述模具柱12的轴线倾斜设置。且沿所述插置方向，每段所述缓冲节段1221的侧壁与所述轴线的夹角依次减小，即三段所述缓冲节段1221为首尾相接且母线与所述轴线的夹角依次减小的三个圆台。优选地，沿所述插置方向，每段所述缓冲节段1221的轴向长度逐步缩减，以在所述第二节段122有限的轴向长度内形成较为平缓的过渡结构连接所述半球体123。

如图3所示，所述缓冲腔22对应三段所述缓冲节段1221形成三层从上往下逐渐变陡的缓冲平台221，在更换或者添加所述细胞培养孔2内的液体时，由于所述缓冲腔22具有多级缓冲平台221，可逐步减弱液体进入时的流动力，从而避免由于液体流动产生过大的剪切力影响所述培养腔23内细胞的生长，以保护所培养的细胞。

应当理解的是，本实施例中根据孔板的孔径和孔深适配设有三段所述缓冲节段1221，以确保所述缓冲节段1221的加工精度和保证所述缓冲腔22具有足够的缓冲效果，在其他实施方式中，所述第二节段122还可包括两段甚至三段以上层叠设置的所述缓冲节段1221。

更优地，结合图2和图3，所述第一节段121包括与所述第二节段122连接的定位节段1211，所述定位节段1211的侧壁沿所述插置方向朝向所述模具柱12的轴线倾斜设置，即所述定位节段1211为圆台状，所述换液腔21可对应所述定位节段1211形成具有斜面的换液平台211，便于使用移液枪抵接更换所述细胞培养孔2内的液体，相比在竖直结构的边缘直接添加液体，可进一步减弱液体的流动力，更好地保护所培养的细胞。

此外，具有斜面结构的换液平台211还可起到定位液体高度的作用，例如每次吸取液体时，保留剩余液体高度至所述换液平台211的上沿或者下沿，进而可控制每次吸取和添加的液体数量，实现预定更换液体的比例，便于使用者操作。相应地，所述定位节段1211的上沿或者下沿的高度可根据换液量的需求在定制时进行调整。

优选地，所述定位节段1211的母线的延长线与所述缓冲节段1221的侧壁相交，从而使流经所述换液平台211的液体受该换液平台211的引导避免直接冲击所述培养腔23。

如图2所示，所述第一节段121还包括第一连接节段1212，所述第一连接节段1212与所述定位节段1211远离所述第二节段122的一端连接，所述模具柱12通过所述第一连接节段1212与所述连接板11连接，所述第一连接节段1212起到连接所述连接板11作用的同时，可扩大所述换液腔21的空间。在图3中示出，所述换液腔21对应所述第一连接节段1212形成第一储液孔212，保证所述细胞培养孔2具有足够的容积。

进一步地，所述第一连接节段1212为底面半径等于或者稍小于孔板的孔径的圆柱体，本实施例中所述第一连接节段1212为底面半径为0.6mm，稍小于96孔板的孔径，便于在96孔板上进行倒模操作。在其他实施方式中，本领域技术人员可根据的实际使用孔板的孔径调整设置所述第一连接节段1212的底面半径。

如图2所示，所述第二节段122还包括第二连接节段1222和第三连接节段1223，所述第二连接节段1222两端分别抵接所述缓冲节段1221和定位节段1211，所述第三连接节段1223两端分别抵接所述缓冲节段1221和半球体123，所述第二连接节段1222和第三连接节段1223为圆柱或者圆台。对应地，在图3中示出，所述缓冲腔22对应所述第二连接节段1222和第三连接节段1223分别形成第二储液孔222和第三储液孔223，增大所述缓冲腔22容积的同时起三个腔体的过渡作用，增加各个腔体的间距，从而使液体的流动距离变长，进一步减弱液体产生的流动力，避免液体直接冲击所培养的细胞。

本实施例中，所述三维聚球培养腔模具1采用光敏树脂材料由3D打印机一体成型，打印完成后用98％酒精冲净表面墨水，再用紫外灯照射3个小时消毒即可使用，3D打印的加工方式比较便捷且具有较高的加工精度，在实验需要改变孔径、孔深或者容积等数据时，可直接更改打印图纸的数据重新打印模具，方便快捷。在其他实施方式中，所述三维聚球培养腔模具1还可采用无毒无害的有机高分子聚合物、玻璃等材料制成。

如图4所示，作为第二方面，本发明实施例还提供一种癌细胞化疗药物浓度的筛选方法(以下简称“筛选方法”)，所述筛选方法采用上述三维聚球培养腔模具2。具体地，所述筛选方法包括以下步骤：

步骤S1：配置三维聚球培养腔模具1和孔板3，将所述三维聚球培养腔模具1在孔板3上通过倒模操作形成细胞培养孔2，所述倒模操作的步骤具体包括：

(1)取1g琼脂糖加入49ml超纯水内，制备2％浓度的琼脂糖溶液。将琼脂糖溶液倒入带盖玻璃皿内，再放入微波炉中加热2分钟，待溶液沸腾后取出，此时琼脂糖溶液由最先的浑浊状变为透明状。

(2)使用移液枪吸取170μl加热至透明状的琼脂糖溶液加入至96孔板3内(琼脂糖溶液需趁热使用，温度降低会使琼脂糖凝固，影响使用效果)，随后使用镊子夹取所述三维聚球培养腔模具1朝下插置入加有琼脂糖溶液的孔板3内，即所述半球体123位于底部。

(3)将加有琼脂糖溶液的96孔板3放置于冰袋上，使琼脂糖溶液冷却成型。待琼脂糖溶液冷却变白后用镊子将所述三维聚球培养腔模具1快速从96孔板3内取出，此时所述96孔板3内具有由琼脂糖基质4形成可模拟人体环境的细胞培养孔2，所述细胞培养孔2对应所述模具柱12的第一节段121、第二节段122和半球体123分别形成换液腔21、缓冲腔22和半球形的培养腔23。

由于每块96孔板3最多可同时容纳六个所述三维聚球培养腔模具1进行倒模操作，实验中制作十二排具有三维聚球培养功能的细胞培养孔2，总耗时约20分钟，比较高效。

完成上述操作后，每个含有琼脂糖基质4的细胞培养孔2需使用细胞培养液润湿两遍。湿润方法具体为：使用移液枪吸取170μl细胞培养基加入含有琼脂糖基质4的细胞培养孔2内，浸润15分钟后使用移液枪倾斜抵在换液平台211上，吸净细胞培养基，重复上述湿润步骤一遍后完成浸润步骤，此时细胞培养孔2可正常使用。

优选地，在使用所述三维聚球培养腔模具1进行倒模操作之前，需将所述三维聚球培养腔模具1放置于超净工作台上使用紫外灯照射1小时进行消毒处理，达到无菌状态。在其他实施方式中，使用紫外灯照射消毒的时间可适当调整。

步骤S2：取用达到细胞活率以及细胞密度要求的原代分离细胞悬液接种于所述细胞培养孔中进行三维聚球培养，以形成细胞三维聚球。

在本实施例中，示例性地给出原代细胞分离的步骤以及方法。供体术前未经任何抗肿瘤治疗，所述原代细胞分离的步骤具体包括：

(1)在无菌条件下取2.0-5.0cm³大小新鲜肝癌组织，放置于含完全细胞培养基的离心管中，在4℃条件下运送至实验室；

(2)用含双抗(青霉素、链霉素)的基础细胞培养冲肝癌组织两次，用眼科剪剔除坏死组织和血污；

(3)用眼科剪将肝癌组织剪至乳糜状(约3-5分钟)，使用40ml基础培养重悬乳糜状肝癌组织，800转离心3分钟，去除上清，重复该步骤1-2次。

(4)加入0.1％IV型胶原酶，置于摇床内(转速65次/分钟)37℃消化1h；

(5)用100目筛网过滤消化后的细胞悬液；

(6)用完全培养基稀释过滤后的细胞悬液，800转离心3min，弃上清，重复该步骤1次；

(7)加入10mL红细胞裂解液，作用5min；

(8)用完全培养基稀释含肝癌细胞的红细胞裂解液；

(9)800转离心3min，弃去全部上清，用完全培养基重悬，重复该步骤2次；

(10)将原代细胞密度调整为5x10^5-1x10^6个/ml，接种于培养瓶中，在37℃、5％CO2的环境下培养12小时，弃去培养液及未贴壁细胞，更换培养液后培养48小时。

(11)用胰酶消化贴壁的原代细胞，将细胞密度调整至1.8x10^4个/ml，按100μl/孔的量将细胞接种至通过上述方法获得的细胞三维聚球板中。

(12)细胞培养48小时后以80μl/孔的量更换细胞培养液，再培养24小时，可见细胞聚集成大小均一的细胞球(如图5所示)。

(13)细胞开始聚球培养第3天，按150μl/孔的量更换含上述浓度梯度抗癌药物的培养液，12小时后重复该操作一次，培养12小时后再以100μl/孔的量更换含抗癌药物培养液一次。确保每个细胞培养孔2内的药物浓度尽快达到预期目标。

(14)此后每两天以80μl/孔的量跟换含药培养液。

(15)成球细胞与抗癌药物共培养6天后，吸净换液平台211以上的培养液，以100μl/孔的量加入CellTiter-3D Cell Viability Assay试剂，放入摇床后在22℃、100转/分钟的条件下孵育30分钟，即可使用化学发放检测仪测定每个细胞培养孔的化学发光值，间接反映每孔的细胞活率。

在培养过程中，需要更换所述细胞培养孔2内的培养基。更换培养基时，操作者可将微量移液枪的枪头抵靠所述换液平台211实现半量换液，即一次更换50％所述细胞培养孔2中的原有培养基。具体地，所述定位节段1211的上沿或者下沿正好处于所述模具柱12体积的中段位置，从而可通过所述换液平台211的上沿或者下沿的定位实现半量换液。在其他可能的实施方式中，可根据培养需要调整所述定位节段1211的位置，进而实现其他比例的换液需求。

从图5中可以看到肝癌细胞生长为团聚细胞团，进入三维聚球培养状态，肝癌细胞状态良好，说明本实施例中由所述三维聚球培养腔模具1倒模制成的细胞培养孔2能够有效使细胞进入三维聚球培养状态并且生长良好，应用所述三维聚球培养腔模具1能够提高细胞培养的成功率和有效性。

步骤S3：所述细胞三维聚球达到试验要求之后，向所述细胞培养孔2中加入预设浓度梯度的待测药物。

具体地，在加入待测药物时，使用微量移液枪抵靠所述换液平台211进行操作，在此处添加液体(包括添加待测药物以及更新培养基等操作)时，液体在所述换液平台211的引导下，流动方向会避开所述培养腔123，避免所述培养腔123中的细胞免受流体剪切力的影响，或者由于液体流动将培养于所述培养腔123的细胞或细胞团吹出培养腔123。进一步地，由于所述缓冲腔22具有多层缓冲平台221，流体由于从微量移液枪喷出而具有的初速度以及固有惯性，会在所述缓冲平台221减缓流速再缓慢浸入所述培养腔123内，最大程度地保护所述培养腔123内的细胞。

在本实施例中，细胞三维聚球的试验要求是观察到团聚成球的细胞球直径增大至相对恒定的状态。其后即可加入待测药物，同时设置对照组以及空白组，每组设置若干重复的细胞培养孔2，以控制误差。

本案例中提供的化疗药物方案以肝癌治疗的临床实际情况为基础，选用顺铂+5-氟尿嘧啶、奥沙利铂+5-氟尿嘧啶、多柔比星及分子靶向药物索拉菲尼，药物的最高浓度参考该药物以常规剂量作用于病人时的最高血药浓度。待测药物的浓度设置如下：顺铂(8μM、4μM、2μM、1μM、0.5μM、0.25μM)+5-氟尿嘧啶(20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM)、顺铂(8μM、4μM、2μM、1μM、0.5μM、0.25μM)+奥沙利铂(4μM、2μM、1μM、0.5μM、0.25μM、0.6254μM)，多柔比星(2μM、1μM、0.5μM、0.25μM、0.625μM、0.3125μM),索拉菲尼(5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.15625μM)，同时设置空白组和对照组，每个药物浓度设置3个复孔。

步骤S4：与所述待测药物共同培养预定时间后，测定细胞活性指标，以确定针对所述细胞化疗药物及该化疗药物的敏感浓度。

在本实施例中，所培养细胞与抗癌药物共同培养的时间为6d，培养完成后采用ATP法测定细胞活率，计算药物的半数抑制浓度IC₅₀。

图6至图9共同示出了在本发明提供的癌细胞化疗药物浓度的筛选方法与普通二维培养方法中，各个药物针对肝癌细胞的抑制率，其中3D表示所述癌细胞化疗药物浓度的筛选方法，2D表示二维培养方法。图10为根据测得的各细胞培养孔化学放光值采用一定的算法绘制的药敏图谱，在本实施例中示例性地使用SPSS(Statistical Product andService Solutions)软件计算各组药物的半数抑制浓度IC₅₀并绘制药敏图谱。药物IC₅₀小于最高血药浓度则可认为细胞对此药物敏感，该药物敏感性结果可以指导性并有针对性地指引药物适用以及对药物进行配伍适用，敏感性的结果基于本筛选方法而具有针对供体的特殊性，更有针对性。值得注意的是，本实施例中仅示例性地采用以上药物作为示范，在不脱离本发明的指导思想以及技术方案的范围内，操作者可以选用其他药物并应用所述筛选方法。本发明同时可以应用于除肝癌细胞之外的其他癌细胞或其他恶性增殖细胞的药物筛选实验。

从图6至图10中可看出，本发明提供的筛选方法由于采用所述三维聚球培养腔模具1通过倒模制成模拟人体环境的细胞培养孔2，相比普通的二维培养方法，在所述细胞培养孔2内所培养的细胞对药物更加敏感，从而可测得更加精准的实验数据，能够较好地反映体内肿瘤的实际耐药情况。且由于所述细胞培养孔2相比普通的二维培养器皿更加接近人体环境，可有效提高细胞的成活率，使用少量原代肝癌细胞即可在短时间内筛选肿瘤敏感的化疗药物，对指导临床用药具有重要意义。

以上所述仅是本发明的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。