一种黑骨藤有效部位群的HPLC指纹图建立方法

摘要

本发明公开了一种黑骨藤有效部位群的HPLC指纹图的建立方法。该方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好等优点；用该方法还能较为全面地反映黑骨藤有效部位群中所含化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价。且用该方法检测到的黑骨藤有效部位群指纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形均较好，柱效较高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种黑骨藤有效部位群的HPLC指纹图的建立方法，属于药品技术的领域。

背景技术

黑骨藤(Periploca forrestii Schltr.)属于萝摩科(Asclepiadaceae)杠柳属(Periploca)植物，收载于2003版《贵州省中药材、民族药材质量标准》，具有祛风除湿、活血通络、消痹止痛的功能，可舒筋活络、祛风除湿；主治风湿性关节炎、跌打损伤、胃痛、消化不良、闭经、痢疾等。黑骨藤是常用苗药之一，是黑骨藤追风活络胶囊、黑骨藤伸筋透骨液、黑骨藤伸筋透骨喷雾剂的重要组成药味。

中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。在此基础上，如果进一步开展谱效学研究，可使中药质量与其药效真正结合起来，有助于阐明中药作用机理。目前，尚无黑骨藤有效部位群HPLC指纹图谱研究工作的报道。

发明内容

本发明目的在于，提供一种黑骨藤有效部位群的HPLC指纹图的建立方法。该方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好等优点；用该方法还能较为全面地反映黑骨藤中所含化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价。且用该方法检测到的黑骨藤指纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形较好，柱效较高。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案实现：一种黑骨藤有效部位群的HPLC指纹图建立方法，包括以下步骤：

(1)混合对照品溶液的制备：取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和异绿原酸C标准品，用甲醇定容为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和异绿原酸C浓度均为0.005-0.015g·mL^-1混合对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：精密称定黑骨藤粗粉100.0g，用乙醇回流提取，抽滤，浓缩，用蒸馏水定容1000mL，得样品溶液；精密称取D101大孔吸附树脂装入层析柱，蒸馏水冲洗至层析柱下端流出液体清澈无色后，将样品溶液上样进行吸附，待吸附完全后以蒸馏水洗脱，然后以乙醇洗脱，收集层析柱流出的乙醇部分，浓缩，烘干，研磨，得黑骨藤有效部位群粉末；精密称取黑骨藤有效部位群粉末，用甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，得供试品溶液；

(3)指纹图谱的制作：色谱条件：色谱柱：Xtimate C₁₈，4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)；梯度洗脱，检测波长360nm，流速1mL·min^-1，柱温38℃，进样量10μL；记录谱图得到黑骨藤有效部位群的HPLC指纹图谱；

(4)标准指纹谱图的确认：按照上述提供的方法，对多批次黑骨藤有效部位群建立了HPLC指纹图谱，通过分析比较确定了24个共有峰，这些共有峰构成了黑骨藤有效部位群的指纹特征，作为黑骨藤有效部位群的标准指纹图谱。

前述的黑骨藤有效部位群的HPLC指纹图建立方法中，所述混合对照品溶液这样制备：取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和异绿原酸C标准品，用甲醇定容为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和异绿原酸C浓度均为0.01mg·mL^-1混合对照品溶液。

前述的黑骨藤有效部位群的HPLC指纹图建立方法中，所述供试品溶液这样制备：精密称定黑骨藤粗粉100.0g，用70％乙醇回流提取三次，加入的乙醇量分别为8倍、8倍、6倍，提取时间分别为1.5h、1.5h、1.0h，将三次滤液合并，抽滤，浓缩至180-220mL，用蒸馏水定容至1000mL，得样品溶液；精密称取100gD101大孔吸附树脂装入层析柱，蒸馏水冲洗至层析柱下端流出液体清澈无色后，将1000mL样品溶液上样进行吸附，待吸附完全后以1200mL蒸馏水洗脱，然后以2500mL70％乙醇洗脱，收集层析柱流出的70％乙醇部分，浓缩，烘干，研磨，得黑骨藤有效部位群粉末；精密称取黑骨藤有效部位群粉末50.0mg，用70％甲醇定容至10mL，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，得供试品溶液。

前述的黑骨藤有效部位群的HPLC指纹图建立方法中，所述的梯度洗脱是：流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)；梯度洗脱程序是：0～15min，11％～11％A；15～30min，11％～18％A；30～40min，18％～18％A；40～50min，18％～23％A；50～60min，23％～25％A；60～85min，25％～32％A。

前述的黑骨藤有效部位群的HPLC指纹图建立方法中，所述24个共有峰，以3号峰绿原酸为参照峰，其相对保留时间分别为0.570、0.595、1.000、1.110、1.587、1.851、1.981、2.117、2.177、2.436、2.561、2.720、3.317、4.092、4.277、4.360、4.443、4.580、4.844、4.886、5.730、5.879、6.169、6.424。

发明人进行了大量的实验，以下是本发明所述检测方法的研究

实验例：黑骨藤有效部位群的HPLC指纹图谱研究

1黑骨藤有效部位HPLC指纹图谱测定条件

1.1仪器与试剂

表1实验仪器表

试剂甲醇、乙腈为色谱纯，乙醇是医用乙醇，磷酸为分析纯，水为双蒸水和娃哈哈纯净水，另有D-101大孔树脂等。

1.2供试品溶液和对照品溶液的制备

1.2.1对照品溶液制备

精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸C标准品适量，用甲醇定容为浓度为0.01mg·mL^-1标准品溶液。

1.2.2供试品溶液的制备

精密称定黑骨藤粗粉(贵州龙宫)100.0g，用70％乙醇回流提取三次，加入的乙醇量分别为8倍、8倍、6倍，提取时间分别为1.5h、1.5h、1.0h，将三次滤液合并，抽滤，浓缩至约200mL，用蒸馏水定容至1000mL，得样品溶液。精密称取100gD101大孔吸附树脂装入层析柱，蒸馏水冲洗至层析柱下端流出液体清澈无色后，将1000mL样品溶液上样进行吸附，待吸附完全后以1200mL蒸馏水洗脱，然后以2500mL70％乙醇洗脱，收集层析柱流出的70％乙醇部分，浓缩，烘干，研磨，得黑骨藤有效部位群粉末。精密称取黑骨藤有效部位群粉末50.0mg，用70％甲醇定容至10mL，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，得供试品溶液。

1.3色谱条件

色谱柱为Xtimate C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱(见表2)，检测波长360nm，流速1mL·min^-1，柱温38℃，进样量10μL。

表2流动相洗脱条件

将对照品按照相同色谱条件进样考察，通过对各色谱峰的保留时间和色谱行为进行比较，共指认了4个色谱峰，分别为2号峰(新绿原酸)、3号峰(绿原酸)、4号峰(隐绿原酸)、15号峰(异绿原酸C)。见图1和图2：

2方法学考察

为了考察和证明所要采用的指纹图谱测量评价方法是可靠的、可重复的，是符合中药指纹图谱测定的条件，为此对实验的方法进行了方法学的验证。指纹图谱分析过程复杂，影响因素较多，因此需要进行方法学验证实验对测定结果整体过程验证，为药材的质量控制提供可靠的数据资料和过程分析控制节点，这方面需要在做研究时给予充分的考虑。鉴于此，本部分对实验方法的精密度、重复性与稳定性进行了方法学考察。

2.1精密度实验

精密称取黑骨藤有效部位群粉末(贵州龙宫)50.0mg，用70％甲醇定容至10mL，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，得供试品溶液，按“1.3”项下色谱条件连续进样6次，计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3.0％，表明仪器精密度良好。见表3、表4、表5和表6。

表3精密度试验保留时间

表4精密度试验峰面积

表5精密度试验相对保留时间

表6精密度试验相对峰面积

2.2稳定性实验

精密称取黑骨藤有效部位群粉末(贵州龙宫)50.0mg，用70％甲醇定容至10mL，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，得供试品溶液，按“1.3”项下色谱条件分别在0、2、4、8、24、36h进样，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3.0％，实验表明了供试品溶液在常温下36h内稳定。见表7、表8、表9和表10。

表7稳定性试验保留时间

表8稳定性试验峰面积

表9稳定性试验相对保留时间

表10稳定性试验相对峰面积

2.3重复性实验

精密称取黑骨藤有效部位群粉末(贵州龙宫)50.0mg，6份，用70％甲醇定容至10mL，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，得供试品溶液，分别按“1.3”项下色谱条件进行分析，计算各共有色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3.0％，表明所用的方法重复性较好。见表11、表12、表13和表14。

表11重复性试验保留时间

表12重复性试验峰面积

表13重复性试验相对保留时间

表14重复性试验相对峰面积

3黑骨藤有效部位群HPLC指纹图谱的建立

为建立黑骨藤有效部位群指纹图谱，共采集11批不同来源的黑骨藤，经鉴定为黑骨藤(Periploca forrestii Schltr.)，分别编号为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11。样品详细来源见表15。精密称取11批不同来源的黑骨藤药材粉末100.0g，按照“1.2.2”项下方法制备供试样品溶液，按“1.3”项下色谱条件进样并记录色谱图。通过对11批样品色谱图分析，共标示出24个共有峰，11批黑骨藤有效部位群共有峰见图3-图5，共有模式的对照指纹图谱见图2。11批黑骨藤样品的有效部位群指纹图谱各共有峰保留时间和峰面积见表16和表18，以3号峰(绿原酸为参照峰)，11批黑骨藤样品的有效部位群指纹图谱各共有峰相对保留时间和相对峰面积见表17和19。

表15 11批不同来源黑骨藤样品信息

表16 11批黑骨藤样品有效部位群指纹图谱各共有峰保留时间

表17 11批黑骨藤样品有效部位群指纹图谱各共有峰相对保留时间

表18 11批黑骨藤样品有效部位群指纹图谱各共有峰峰面积

表19 11批黑骨藤样品有效部位群指纹图谱各共有峰相对峰面积

3.1黑骨藤有效部位群指纹图谱相似度

利用国家药典委员会相似度评价软件以S1号样品的色图谱为参照图谱，平均数生成法，“时间窗宽度”为0.1min，多点校正后进行自动匹配，生成对照图谱，得到各产地黑骨藤有效部位群HPLC指纹图谱相似度，见表20。11批黑骨藤有效部位群相似度在0.837～0.989之间范围，其中有3批产地的黑骨藤有效部位群相似度值在0.9以下，其余8批黑骨藤有效部位群的相似度在0.9以上。

表20 11批黑骨藤样品HPLC指纹图谱相似度

3.2共有峰的标定

1、对照品来源及批号见表21。

表21对照品来源及批号

2、将上述各对照品按照相同色谱条件进样考察，通过对各色谱峰的保留时间和色谱行为进行比较，共指认了4个色谱峰，分别为2号峰(新绿原酸)、3号峰(绿原酸)、4号峰(隐绿原酸)、15号峰(异绿原酸C)。见图5和图6。

4结果与结论

1色谱条件的优化研究

1.1流动相的确定

指纹图谱的色谱条件要使色谱图尽可能多地反映药材里的化学成分数量及其成分比例，为得到黑骨藤有效部位群的特征指纹图谱，在前期研究基础上，对下面四组流动相进行比较选择：

第一组：乙腈-0.1％磷酸水溶液按不同梯度进行测定。

第二组：四氢呋喃-0.1％磷酸水溶液按不同梯度进行测定。

第三组：甲醇-0.1％磷酸水溶液按不同梯度进行测定。

第四组：甲醇-0.2％磷酸水溶液按不同梯度进行测定。

由色谱图可知，以乙腈-0.1％磷酸水溶液作为流动相，渐变梯度洗脱效果最好，色谱图中的色谱峰较多，分离度较好，保留时间适中，故而选择乙腈-0.1％磷酸水溶液作为流动相。

1.2黑骨藤有效部位群HPLC指纹图谱柱温的考察

为了得到更佳的色谱图，本实验对柱温也进行了考察，柱温分别为30℃、35℃、38℃、40℃，通过对色谱图进行比较，可知柱温为38℃时色谱峰分离度最好，故本研究最终选定柱温为38℃。

1.3检测波长的选择

本实验选择了220、254、274、360nm四个波长进行测定，在360nm下出现的色谱峰较多，并且大部分色谱峰吸收较强，故本实验选择360nm作为检测波长。

1.4供试品溶剂的考察

对供试品溶剂为60％甲醇、70％甲醇、80％甲醇分别进行考察，从得到的色谱图可知，当溶剂为70％甲醇时，各主要色谱峰的峰面积随之后溶剂用量的增加不再有影响，所以本实验最终确定供试品溶剂浓度为70％甲醇。

以上试验表明，该测定方法稳定可靠，指纹图谱相对稳定，可以用于控制黑骨藤有效部位群的质量。

与现有技术相比，该方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好等优点；用该方法还能较为全面地反映黑骨藤有效部位群中所含化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价。且用该方法检测到的黑骨藤有效部位群指纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形和柱效好。

附图说明

图1是对照品高效液相实验色谱图；

图2是黑骨藤样品高效液相实验色谱图；

图3是11批黑骨藤有效部位群HPLC指纹图谱；

图4是11批黑骨藤有效部位群HPLC对照图谱；

图5是混合对照品的HPLC图谱；

图6是共有模式的对照指纹图谱。

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

具体实施方式

实施例1：

一种黑骨藤有效部位群的HPLC指纹图的建立方法，包括以下步骤：

一种黑骨藤有效部位群的HPLC指纹图建立方法，包括以下步骤：

(1)混合对照品溶液的制备：取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和异绿原酸C标准品，用甲醇定容为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和异绿原酸C浓度均为0.01mg·mL^-1混合对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：精密称定黑骨藤粗粉100.0g，用70％乙醇回流提取三次，加入的乙醇量分别为8倍、8倍、6倍，提取时间分别为1.5h、1.5h、1.0h，将三次滤液合并，抽滤，浓缩至180-220mL，用蒸馏水定容至1000mL，得样品溶液；精密称取100gD101大孔吸附树脂装入层析柱，蒸馏水冲洗至层析柱下端流出液体清澈无色后，将1000mL样品溶液上样进行吸附，待吸附完全后以1200mL蒸馏水洗脱，然后以2500mL70％乙醇洗脱，收集层析柱流出的70％乙醇部分，浓缩，烘干，研磨，得黑骨藤有效部位群粉末；精密称取黑骨藤有效部位群粉末50.0mg，用70％甲醇定容至10mL，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，得供试品溶液；

(3)指纹图谱的制作：色谱条件：色谱柱：Xtimate C₁₈，4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)；梯度洗脱，梯度洗脱程序是：0～15min，11％～11％A；15～30min，11％～18％A；30～40min，18％～18％A；40～50min，18％～23％A；50～60min，23％～25％A；60～85min，25％～32％A。检测波长360nm，流速1mL·min^-1，柱温38℃，进样量10μL；记录谱图得黑骨藤有效部位群的HPLC指纹图谱；

(4)标准指纹谱图的确认：按照上述提供的方法，对多批次黑骨藤有效部位群建立了HPLC指纹图谱，通过分析比较确定了24个共有峰，这些共有峰构成了黑骨藤有效部位群的指纹特征，作为黑骨藤有效部位群的标准指纹图谱。所述24个共有峰，以3号峰绿原酸为参照峰，其相对保留时间分别为0.570、0.595、1.000、1.110、1.587、1.851、1.981、2.117、2.177、2.436、2.561、2.720、3.317、4.092、4.277、4.360、4.443、4.580、4.844、4.886、5.730、5.879、6.169、6.424。