一类基于荧光素衍生物的内标比率型荧光探针、制备方法及其应用

摘要

本发明涉及一类基于荧光素衍生物的内标比率型荧光探针、制备方法及其应用，以荧光素衍生物作为起始原料，以丙二腈、三氰基苯、吲哚、吡喃腈等作为辅助荧光单元，以丙烯酰基、2,4‑二硝基苯磺酰基等作为生物标志物响应单元。通过引入辅助荧光单元，实现了对该类荧光探针吸收波长及双通道荧光发射波长的调控：吸收波长为400nm‑750nm；双通道荧光发射，通道一发射波长为520nm，通道二发射波长为517nm‑720nm。针对不同生物标志物的检测，通过连接不同的识别基团，实现了对通道一荧光强度调控：探针与生物标志物响应后，通道一荧光强度显著增强；通道二荧光强度保持不变，实现了内标比率型荧光探针对生物标志物的定量检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一类基于荧光素衍生物的内标比率型荧光探针及其应用。

背景技术

利用荧光探针探索生命过程和研究疾病诊疗是非常有效的手段之一。而目前对荧光探针的主要需求是：(1)合成和生物学过程相关的更灵敏有效的荧光探针；(2)合成的荧光探针能够提供定量的荧光信号，该信号与激发强度或探针浓度无关。在这方面，最优选的策略是设计比率型荧光探针。比率型荧光探针与生物标志物反应后，通过两个不同荧光发射波长的荧光强度的比值，提供一个与探针浓度，激发光强度无关的信号，该比值与生物标志物浓度相关，所以可以提供定量关系。

传统的比率型荧光探针的设计策略是通过与生物标志物反应前后，出现荧光发射波长的偏移来进行设计。该类荧光探针的缺陷是：(1)反应前后作为参比的荧光发射峰强度发生变化，无法提供固定的荧光信号从而导致荧光比值产生误差；(2)反应前后光谱不能完全分离，导致提供的比值误差大；(3)反应前的荧光发射峰会逐渐降低，导致假阳性信号和错误的荧光比值。所以设计一个具有内标的比率型荧光探针是目前的研究重点。

目前对内标比率型荧光探针的研究非常少，现有的少量文献一般是通过引入两个荧光单元来进行设计。而引入两个荧光单元的缺陷是：(1)两个荧光单元之间可能会有不必要的能量转移；(2)同一生物环境对两个荧光单元的荧光性质影响不同；(3)不能使用同一激发波长激发两个荧光单元。所以这些都限制了内标比率型荧光探针的发展。

鉴于此，设计并合成内标比率型荧光探针，成为本发明需要解决的技术问题。

发明内容

本发明涉及一类基于荧光素衍生物的内标比率型荧光探针及其应用，以荧光素衍生物作为起始原料，以丙二腈、三氰基苯、吲哚、吡喃腈等作为辅助荧光单元，以丙烯酰基、2，4-二硝基苯磺酰基等作为生物标志物响应单元。通过引入辅助荧光单元，实现了对该类荧光探针吸收波长及双通道荧光发射波长的调控：吸收波长为400nm-750nm(黄、橙红、红、紫、深蓝)；双通道荧光发射，通道一发射波长为520nm，通道二发射波长为517nm-720nm。针对不同生物标志物的检测，通过连接不同的识别基团，实现了对通道一荧光强度调控：探针与生物标志物响应后，通道一(520nm)荧光强度显著增强；通道二荧光强度保持不变，实现了内标比率型荧光探针对生物标志物的定量检测。

1.一种基于荧光素衍生物的内标比率型荧光探针，其为式I所示化合物：

式I中；

A为O族元素或其他元素；

B为O，S，N-R₁；R₁选自H，NH₂，烃基或取代烃基，或芳基；

C为O、或式II所示基团：丙二腈(II-1)或三氰基化合物(II-2)或多元取代杂环(II-3，4，5)；

其中所述式II中，式II-2中：R₂选自芳基；式II-3中：R₃选自O或N-R₁₂，R₁₂选自烃基或取代烃基，或芳基；R₄，R₅分别独立选自：H，C₁～C₃的烃基或R₄与R₅的组合为芳基；式II-4中：R₆与R₇的组合为芳基；R₈选自烃基或取代烃基，或芳基；式II-5中：>9选自H，烃基或取代烃基，或芳基；R₁₀和R₁₁选自烃基或取代烃基或芳基，或卤素原子。

D为O-R₁₃，NH-R₁₄，R₁₃，R₁₄分别独立选自H，或式对生物标志物有识别性能的检测基团。

E为H或烃基或取代烃基，或芳基；

本发明另一个目的在于，揭示上述式I所示化合物的一种用途，即式I所示化合物作为内标比率型荧光探针的应用；或者说，在制备基于荧光素衍生物的内标比率型荧光探针并应用。

此外，本发明还有一个目的在于，提供一种制备式I所示化合物的方法，所示方法的主要步骤是：以荧光素为起始原料，依次经过Vilsmeier-Haack反应、与卤代不饱和烃进行反应和与含有活泼亚甲基的不同共轭基团进行缩合反应等得到目标化合物。

相对于现有的比率型荧光探针而言，本发明所提供的基于荧光素衍生物的内标比率型荧光探针具有特有的内标比率型双荧光发射特征、合成比较简单、合成步骤较少、而且原料成本低廉和易于大规模的商业化生产等优点。

附图说明

图1.式I-1D所示化合物(详见实施例1)在不同pH的乙腈/水(v/v：7/3)的混合溶剂中的吸收光谱和荧光发射光谱。

图2.式I-1D-1所示化合物(详见实施例2)与不同当量的半胱氨酸(Cys)反应的荧光发射光谱。

图3.式I-1D-2所示化合物(详见实施例3)与不同当量的谷胱甘肽(GSH)反应的荧光发射光谱。

图4.A549细胞孵育式I-1D所示化合物(详见实施例1)，在不同pH环境下，同一激发波长，双荧光成像和寿命成像。

具体实施方式

在本发明一个优选的技术方案中，其特征在于，式I中，

式I中，

A为O，S，Si；

B为O，S，N-R₁；R₁选自H，NH₂，C₁～C₄的烃基或取代烃基，或苯基或取代苯基；

C为O、或式II所示基团：丙二腈(II-1)或三氰基化合物(II-2)或多元取代杂环(II-3，4，5)；

其中所述式II中，式II-2中：R₂选自六元芳基；式II-3中：R₃选自O或N-R₁₂，>12选自C₁～C₄的直链或支链烷基；R₄与R₅的组合为苯基或取代苯基；式II-4中：R₆与>7的组合为苯基或取代苯基；R₈选自C₁～C₄的直链或支链烃基；式II-5中：R₉选自H，C₁～C₃的直链或支链烷基；R₁₀和R₁₁选自苯基或卤素原子。

D为O-R₁₃，NH-R₁₄，R₁₃，R₁₄分别独立选自H，或对生物标志物有识别性能的基团：如式III所示基团，R₁₅，R₁₆分别独立选自烃基或取代烃基，或芳基。

E为H、或式IV所示基团：R₁₇为烃基或取代烃基，或芳基；

进一步优选的：其特征在于，式I中C为O、或式II所示基团：丙二腈(II-1) 或三氰基化合物(II-2)或多元取代杂环(II-3，4，5)；

其中所述式II中，式II-2中：R₂选自苯基；式II-3中：R₃选自O或N-R₁₂，R₁₂选自C₁～C₄的直链烷基；R₄与R₅的组合为苯基；式II-4中：R₆与R₇的组合为苯基或式V；>8选自C₁～C₄的直链烷基；式II-5中：R₉选自H，C₁～C₃的直链烷基；R₁₀和R₁₁选自苯基或F。

进一步优选的：其特征在于，式I中，C为O、或式II所示基团：丙二腈(II-1) 或三氰基化合物(II-2A)或多元取代杂环(II-3A，3B，4A，5A)；

其中所述式II中，式II-2中：R₂选自苯基；式II-3中：R₃选自O或N-R₁₂，R₁₂选自乙基；R₄与R₅的组合为苯基；式II-4中：R₆与R₇的组合为式V；R₈选自乙基；式II-5>9选自甲基；R₁₀和R₁₁选自F。

进一步优选的：其特征在于，式I中，A为O，Si。

进一步优选的：其特征在于，式I中，A为O。

进一步优选的：其特征在于，式I中，B为O。

进一步优选的：其特征在于，式I中，D为O-R₁₃，NH-R₁₄，R₁₃，R₁₄分别独立选自H，或对生物标志物有识别性能的基团：如式III-1A，III-1B，III-1C，III-2A。

进一步优选的：其特征在于，式I中，E为H、或式IVA，IVB。

进一步优选的：其特征在于，式I为式I-1，I-2，I-3：

进一步优选的：其特征在于，式I为式I-1A，I-2A，I-1B，I-1C，I-1D，I-2D， I-1E，I-1F，I-1G：

本发明推荐的式I是下列化合物：

下面以式I所示化合物中，A为O；B为O；C为O或II-3A所示基团；D为式III-1A或III-2A所示基团；E为H为例，对合成式I所示化合物的方法做进一步阐述，所述合成方法包括如下步骤：其以荧光素为起始原料，依次经过Vilsmeier-Haack反应、与卤代不饱和烃进行反应和与含有活泼亚甲基的不同共轭基团进行缩合反应等得到目标化合物。

下面通过实例对本发明作进一步的阐述，其目的仅在于更好地理解本发明的内容。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围：

实施例1

在100mL三口瓶中，加入DMF(15mL)，POCl₃(0.5mL)和荧光素(4g，12mmol)。反应48h后结束反应，丙酮重结晶得黄色固体0.5g，产率11.2％。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆，ppm)：δ6.61(s，1H)，6.62(d，J＝1.2Hz，1H)，6.72(d，>

Mass spectrometry(ESI negative ion mode for[M-H]^-)：calcd>21H₁₁O₆]：359.0556；found：359.0555.

在100mL三口烧瓶中，加入荧光素醛(500mg，1.39mmol)和乙酸酐(50mL)。将 2-Bromocyclohex-1-ene-1-carbaldehyde(523mg，2.78mmol)加到三口烧瓶中，室温反应2h。反应过程中，颜色逐渐变成血红色。结束反应后，旋干溶剂。吡啶重结晶得到橘红色固体125mg，产率20％。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆，ppm)：δ1.69(t，2H，-CH₂)，2.33(t，2H，-CH₂)，2.73>2)，6.61(s，2H，Ph-H)，6.74(d，1H，Ph-H)，6.84(s，1H，Ph-H)，6.98(d，1H，Ph-H)，7.30(d，1H，Ph-H)，7.47(s，1H，alkene-H)，7.74(t，1H，Ph-H)，7.81(t，1H，Ph-H)，8.02(d，1H，>

Mass spectrometry(ESI negative ion mode for[M-H]^-)：calcd>28H₁₇O₆]：449.1028；found：449.1025.

在100mL三口烧瓶中，加入荧光素醛(130mg，0.29mmol)、苯并吡喃腈(89mg，0.43mmol)和乙酸酐(35mL)。氩气保护下，反应1h，反应过程中，溶液由亮黄色变成黑紫色，结束反应。旋干溶剂，苯重结晶得到黑紫色固体60mg，产率32％。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆，ppm)：δ1.80(m，2H，-CH₂)，2.69(m，2H，-CH₂)，6.58>

Mass spectrometry(ESI negative ion mode for[M-H]^-)：calcd>41H₂₃N₂O₆]：>

实施例2

在50mL三口瓶中加入荧光素衍生物(50mg，0.078mmol)，二氯甲烷(15mL)，丙烯酰氯(0.5mL)。室温反应18h后，结束反应。旋干溶剂，二氯甲烷重结晶得黑紫色固体 10mg，产率18％。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃，ppm)：δ1.91(m，2H，-CH₂)，2.52(t，2H，-CH₂)，2.68(t，>2)，6.08(d，J＝10.44Hz，1H，alkene-H)，6.15(d，J＝15.52Hz，1H，alkene-H)，6.34(dd，>1＝10.48Hz，J₂＝17.32Hz，1H，alkene-H)，6.64(d，J＝8.68Hz，1H，Ph-H)，6.65(d，J＝17.32Hz，1H，alkene-H)，6.77(s，1H，alkene-H)，6.79(d，J＝8.92Hz，1H，Ph-H)，6.83(s，1H，Ph-H)，>

Mass spectrometry(EsI negative ion mode for[M+H]⁺)：calcd>44H₂₇N₂O₇]：>

实施例3

在50mL三口瓶中加入荧光素衍生物(50mg，0.078mmol)，2，4-二硝基苯磺酰氯(41mg，0.156mmol)，二氯甲烷(15mL)。室温反应18h后，结束反应。旋干溶剂，二氯甲烷重结晶得黑紫色固体10mg，产率14％。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆，ppm)：δ1.80(m，2H，-CH₂)，2.67(m，2H，-CH₂)，6.75>1＝8.72Hz，J₂＝2.28Hz，1H，Ph-H)，8.70(d，J＝8.76Hz，1H，Ph-H)，9.14(d，J＝2.28Hz，1H，>

Mass spectrometry(ESI negative ion mode for[M+H]⁺)：calcd>47H₂₇N₄O₁₂S]：>