短乳杆菌ZJ401及其应用

摘要

本发明提供了一株具有抗氧化活性的短乳杆菌ZJ401及其应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC M 2017666，保藏日期：2017年11月7日。该菌可以显著提高A549细胞中SOD和CAT活性，显著降低细胞上清中LDH及细胞中ROS的含量，显著升高Caco‑2细胞中Nrf2与γ‑GCS基因的表达。将该短乳杆菌ZJ401制备成菌粉后制成机体抗氧化食品或保健品，直接食用或冲服饮用，使用方便，可增强机体免疫力。该短乳杆菌ZJ401对微生态活菌制剂、功能性发酵乳制品的开发具有重要研究意义及应用前景。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一株具有体内和体外细胞抗氧化应激损伤活性的菌种——短乳杆菌(Lactobacillus breris)ZJ401及其应用。

(二)背景技术

1956年英国的学者Harmna首先提出了自由基衰老学说，自由基衰老理论(FRTA)假定老化变化是由自由基反应引起的。1990年美国衰老研究权威Sohal教授指出了自由基衰老理论的缺陷，并首次提出了氧化应激这个概念。氧化应激即机体自由基生成增加或清除能力降低，引起机体氧化系统和抗氧化系统紊乱，导致自由基在体内积累而引起的氧化损伤过程。氧化应激不仅与衰老有着密不可分的关系，研究还证明氧化应激与肿瘤的发生、哮喘、抑郁症及各种慢性炎症等疾病息息相关。氧化应激还参与心血管疾病发生、发展多种病理生理过程，引发动脉粥样硬化、心力衰竭、高血压、心肌损伤等多种心血管疾病。

机体自身的抗氧化能力有限，因此通过摄入外源性的抗氧化剂成为了机体缓解氧化应激的重要途径。乳酸菌是一种被人类广泛利用的益生菌，常常被用在食品发酵工业及微生态制剂种。众所周知，乳酸菌具有调节肠道菌群，提高人体免疫力等功能。现已有研究发现有些乳酸菌能够清除DPPH，羟自由基等活性氧自由基，缓解氧化应激。因此将功能乳酸菌作为天然食品添加剂可以缓解氧化应激以及一些疾病的发生。筛选具有较好缓解氧化应激功能的乳酸菌具有重要意义及市场价值。本发明通过体外抗氧化实验从传统自制的发酵食品中筛选出具有缓解氧化应激的乳酸菌，以期为开发具有缓解氧化应激功能的乳酸菌食品发酵剂奠定基础及理论依据。

(三)发明内容

本发明目的是为了提供一株具有体内和体外细胞抗氧化应激损伤活性的新菌株——短乳杆菌(Lactobacillus breris)ZJ401。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新菌株--短乳杆菌(Lactobacillus breris)ZJ401，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2017年11月7日，保藏编号：CCTCC No：M2017666，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。本发明从腌制蔬菜中，通过初筛，复筛，获得具有抗氧化功能的纯培养物，经形态学鉴定、生理生化试验鉴定、16S rDNA序列分析，确定该株菌为短乳杆菌(Lactobacillus breris)，命名为短乳杆菌ZJ401(Lactobacillus brerisZJ401)。

本发明还涉及所述的短乳杆菌ZJ401在制备细胞抗氧化剂中的应用，所述细胞为人肺癌细胞A549或人结肠癌细胞Caco-2，所述细胞抗氧化剂能够提高细胞中SOD和CAT活性，降低细胞上清中LDH及细胞中ROS的含量，增加细胞Nrf2、SOD与HO-1基因表达量。

所述细胞抗氧化剂为是短乳杆菌ZJ401经发酵培养获得的湿菌体或者湿菌体超声破碎后的上清液，按如下方法制备：

(1)将短乳杆菌ZJ401接种至MRS固体培养基，37℃培养24h，获得斜面菌体；MRS固体培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母膏10.0g/L，柠檬酸二铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，磷酸氢二铵2.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温-801mL/L，18g/L琼脂，溶剂为去离子水，pH值5.0；

(2)将斜面菌体接种至MRS液体培养基，37℃培养16h，获得种子液；所述MRS液体培养基是去除MRS固体培养基中的琼脂；

(3)将种子液以体积浓度3％的接种量接种至MRS液体培养基，37℃发酵培养，获得含湿菌体的发酵液，即为完整细胞悬液，浓度为10⁹cfu/kg；将5ml上述完整细胞悬液超声破碎，功率400W，工作5s，停5s，60次，超声破碎后将菌悬液4℃，10000r/min离心10min，收集上清4ml，为无细胞提取物。

本发明还提供一种短乳杆菌ZJ401在制备抗氧化饲料中的应用，所述抗氧化饲料中短乳杆菌ZJ401含量为10⁹cfu/kg以上，优选10⁹cfu/kg。

本发明还提供一种所述短乳杆菌ZJ401在制备抗氧化食品或保健品中的应用，所述抗氧化食品或保健品中短乳杆菌ZJ401含量为10⁹cfu/kg以上。

本发明的有益效果主要体现在：本发明筛选得到一株具有抗氧化活性的短乳杆菌ZJ401，该菌不仅具高抗氧化活性，还具有良好的耐酸耐胆盐特性。ZJ401的无细胞提取物的DPPH清除率为25.68％，羟自由基清除率为23.72％，还原活性相当于104.67μmol/L L-半胱氨酸。ZJ401的发酵液与无细胞提取物可以显著提高A549细胞中SOD和CAT活性，显著降低细胞上清中LDH及细胞中ROS的含量。在Caco-2氧化应激模型中，可以显著提高培养上清中总抗氧化能力，ZJ401的完整细胞悬液能显著升高Caco-2细胞中Nrf2与γ-GCS基因的表达。将该短乳杆菌ZJ401制备成菌粉后制成机体抗氧化食品或保健品，直接食用或冲服饮用，使用方便，可增强机体免疫力。该短乳杆菌ZJ401对微生态活菌制剂、功能性发酵乳制品的开发具有重要研究意义及应用前景。

(四)附图说明

图1为菌株ZJ401在MRS固体培养基上的菌落形态；

图2为菌株ZJ401的革兰氏染色镜检图片(红色的杆状菌株为阴性对照，紫色杆状为菌株ZJ401)；

图3为菌株ZJ401的生长曲线；

图4为菌株ZJ401的进化树；

图5为菌株ZJ401对ROS生成的影响；A-空白对照组；B-氧化应激对照组；C-FS实验组；D-CFE实验组；E-VC阳性对照组；。

图6为菌株ZJ401对Caco-2细胞中氧化应激相关基因Nrf2(a)、SOD(b)、HO-1(c)、γ-GCS(d)mRNA表达的影响；CFE：无细胞提取物；IC：完整细胞悬液；a～e表示同一种基因中不同组别之间的显著性分析，字母一样表示没有显著性，字母不同表示有显著性(p＜0.05)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：短乳杆菌ZJ401的筛选及鉴定

1、菌株ZJ401的筛选

(1)菌株初筛：用一次性无菌注射器采集传统发酵法制备的泡菜的汤汁，将无菌采集的样品用生理盐水进行梯度稀释，取稀释后的样品100～200μL均匀涂布于pH为5.0的MRS固体培养基上，先在37℃生化培养箱中正置30min待涂布的菌液干后再倒置培养24～48h。对平板上的单菌落进行菌落形态观察，挑选符合乳酸菌形态的菌落(菌落呈圆形，中等大小，凸起，微白色，湿润，边缘整齐)。对分离纯化后的菌落进行革兰氏染色与接触酶试验。革兰氏染色阳性，接触酶试验为阴性的菌株可初步判定为乳酸菌。

(2)耐受性筛选：将活化两次后的菌株以体积浓度3％的接种量分别接种于pH为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0的MRS液体培养基、含猪胆盐质量分数分别为0，0.3％，0.5％的MRS液体培养基、含H₂O₂浓度分别为0.4，0.7，1.0mmol/L的MRS液体培养基。37℃培养16h，通过600nm处吸光值测定选取耐受性最好的菌株。筛选得到可在pH3.0，猪胆盐质量分数0.5％，H₂O₂浓度为1.0mmol/L的环境中保持活性的菌株ZJ401。

(3)样品处理：将菌株ZJ401接种在MRS液体培养基中，37℃培养16h，菌液4℃，4000r/min离心10min，弃上清，收集菌体。菌体用pH为7.2的PBS缓冲液洗涤3次并重悬，调整菌数至1×10⁹cfu/mL为完整细胞悬液；将上述完整细胞悬液超声破碎，功率400W，工作5s，停5s，60次。超声破碎后将菌悬液4℃，10000r/min离心10min，收集上清为无细胞提取物。

(4)抗氧化活性检测及筛选：对完整细胞悬液和无细胞提取物样品进行DPPH清除率、羟自由基清除率、抗脂质过氧化率、螯合亚铁离子能力、还原活性检测，对无细胞提取物进行SOD、GSH-Px、NADH氧化酶活性检测。ZJ401完整细胞与无细胞提取物DPPH清除率分别为19.33％和25.68％，羟自由基清除率分别为19.82％和23.72％，抗脂质过氧化能力分别为12.11％和8.62％，螯合亚铁离子能力分别为12.61％和15.43％，还原活性分别相当于97.00μmol/L和104.67μmol/L L-半胱氨酸的量。ZJ401的SOD活性为7.068U/mgprot，GSH-Px活性为156.73U/mgprot，NADH氧化酶活性为0.0615U/mgprot。

MRS液体培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母膏10.0g/L，柠檬酸二铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，磷酸氢二铵2.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温-80 1mL/L，溶剂为去离子水，pH值5.0。

MRS固体培养基是在MRS液体培养基中添加18g/L琼脂。

2、菌株ZJ401的鉴定

(1)菌落形态鉴定：菌株ZJ401接种在MRS固体培养基上，37℃培养24h，单菌落呈微白色，凸起且光滑湿润的圆形(如图1所示)。镜检下可以看到菌株ZJ401革兰氏为阳性，形态呈现为直的或者微弯曲的短杆状，有时单个、有时为成对或者链状(如图2所示)。菌株ZJ401在6h时生长进入对数期，18h以后菌体生长进入平稳期，菌株ZJ401的对数生长期为6～18h，发酵液的pH从最初的6.0最后降到4.4(如图3所示)。

(2)生理生化鉴定：将菌株ZJ401接种在MRS固体培养基上，在37℃下培养24h，再转接入API50CHL培养基中，利用麦氏比浊管制成2个麦氏浓度的菌悬液。将菌悬液接入API50CH试剂条中，37℃厌氧培养24-48h。生理生化结果显示菌株ZJ401在24h、48h结果均是短乳杆菌Lactobacillus brevis(具体生理生化结果见表1所示)。

表1菌株ZJ401生理生化结果

(3)分子鉴定：对菌株ZJ401的DNA进行PCR扩增，以细菌16S rDNA通用引物，扩增到1455bp的DNA片段(SEQ ID NO.1所示)。序列在NCBI上进行BLAST比对。比对结果显示菌株ZJ401序列同源性最高的菌株为短乳杆菌(相似度99％，序列号NR 116238.1)。从NCBI以上选取同源性高的典型菌种序列，对菌株ZJ401与其发育关系相近的菌株进行遗传距离计算。应用MAGE 5.0软件构建系统发育树(如图4所示)。结合形态，16S rDNA序列对比结果和生理生化测定结果，确定该菌株ZJ401为短乳杆菌(Lactobacillus breris)，命名为短乳杆菌ZJ401(Lactobacillus brerisZJ401)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNo：M 2017666，保藏日期：2017年11月7日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

实施例2短乳杆菌ZJ401发酵液

(1)将短乳杆菌ZJ401接种至MRS固体培养基，37℃培养24h，获得斜面菌体。

(2)将斜面菌体接种至MRS液体培养基，37℃培养16h，获得种子液。

(3)将种子液以体积浓度3％的接种量接种至MRS液体培养基，37℃发酵培养，获得发酵液，即为完整细胞悬液，浓度为10⁹cfu/kg；将5ml上述完整细胞悬液超声破碎，功率400W，工作5s，停5s，60次，超声破碎后将菌悬液4℃，10000r/min离心10min，收集上清4ml，为无细胞提取物。

实施例3短乳杆菌ZJ401体外对A549细胞氧化应激损伤的保护作用

PM2.5溶液制备：将采样滤膜(Whatman PM2.5，购自奥富森)剪成1cm×1cm大小，浸入超纯水中，室温静置30min，超声30min，重复3次以洗脱PM2.5颗粒。获得的滤液用6层纱布过滤，将过滤后的滤液于-80℃冷冻使其成为冻干粉末。使用时加入无菌PBS将其配置成高浓度母液，再稀释成不同浓度的PM2.5溶液。

采用PM2.5溶液作为A549细胞的氧化应激物。A549细胞以每孔1×10⁴个细胞(即浓度为1×10⁵，每孔100μL)铺板于含体积浓度10％小牛血清+体积浓度1％青链双抗(100U/ml)的1640基础培养基的96孔板中，37℃培养24h，待细胞贴壁后吸去培养基，用PBS清洗后，按照表2进行分组，PM2.5加入终浓度为100μg/mL，实施例2制备的短乳杆菌ZJ401的完整细胞悬液(IC)加入量为0.5ml，无细胞提取物(CFE)加入量为0.5ml，Vc加入终浓度为20μg/mL，以等量PBS为空白对照，37℃培养24h。ZJ401的发酵液与无细胞提取物显著提高了细胞中SOD和CAT活性，显著降低了细胞上清中LDH及细胞中ROS的含量，ZJ401对PM2.5所引起A549细胞的氧化应激损伤具有缓解作用(如表3，图5所示)。

表2.实验分组

表3.短乳杆菌ZJ401对A549细胞SOD、CAT、LDH的影响

注：1.表中a～d表示同一抗氧化酶指标下不同组别之间的显著性分析，字母一样表示没有显著性，字母不同表示有显著性(p＜0.05)。

2.CFE：无细胞提取物；IC：完整细胞悬液

实施例4短乳杆菌ZJ401体外对Caco-2细胞氧化应激损伤的保护作用

采用H₂O₂作为Caco-2细胞的氧化应激物。A549细胞以每孔1×10⁴个细胞(即浓度为1×10⁵，每孔100μL)铺板于含体积浓度20％胎牛血清+体积浓度1％青链双抗(100U/mL)的DMEM基础培养基的96孔板中，37℃培养24h，细胞贴壁后吸去培养基，用PBS清洗后，按表4进行分组，其中H₂O₂加入终浓度为100μmol/L，实施例2制备的短乳杆菌ZJ401的完整细胞悬液(IC)添加量为0.5ml，无细胞提取物(CFE)添加量为0.5ml。ZJ401的完整细胞悬液和无细胞提取物显著提高了细胞中的总抗氧化能力(T-AOC)(如表5所示)。

表4.实验分组

表5短乳杆菌ZJ401对Caco-2抗氧化活性影响

注：1.表中a～d表示同一抗氧化酶指标下不同组别之间的显著性分析，字母一样表示没有显著性，字母不同表示有显著性(p＜0.05)。

2.CFE：无细胞提取物；IC：完整细胞悬液

实施例5短乳杆菌ZJ401体外对肠上皮Caco-2细胞Nrf2、SOD、HO-1、γ-GCS mRNA表达的影响

Caco-2细胞购自ATCC。将冻存的细胞从-80℃冰箱或液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴锅中，不时晃动，使细胞融化。在离心管中加入5mL完全细胞培养基与解冻的细胞悬液，1000r/min 3min。离心后，弃上清，加入完全培养基悬浮细胞，用移液枪充分吹打细胞。将细胞悬液转入细胞培养皿中，放于温度37℃，二氧化碳浓度5％的培养箱中，2天更换一次培养液。体外培养肠上皮Caco-2细胞，利用不同剂量(2×10⁵，2×10⁶，2×10⁷CFU)的短乳杆菌ZJ401分别刺激小肠上皮细胞8h，提取刺激后的细胞总RNA，反转录为cDNA，FQ-PCR检测肠上皮细胞Nrf2、SOD、HO-1、γ-GCS>2O₂的刺激下Caco-2细胞产生氧化应激，细胞内的Keap1-Nrf2-ARE信号通路被激活，并激活了下游中SOD、HO-1等抗氧化酶基因。

实施例6日粮中添加短乳杆菌ZJ401对小白鼠抗氧化功能影响

短乳杆菌ZJ401添加于48日龄小白鼠日粮中，使其活菌数达到10⁹cfu/kg，连续饲喂21d后，检测血清T-SOD、MDA。ZJ401可显著提高小白鼠21d血清和肠黏膜总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性(p<0.05)，降低小白鼠21d血清丙二醛(MDA)的含量(p<0.01)，对21d肠黏膜MDA含量也有降低趋势(p＝0.057)，能极显著提高42d血清T-SOD活性和总抗氧化能力(T-AOC)(p<0.01)。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 短乳杆菌ZJ401及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1455

<212> DNA

<213> 短乳杆菌(Lactobacillus breris)

<400> 1

cgtggcgatg ctatactgca gtcgaacgag cttccgttga atgacgtgct tgcactgatt 60

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