越南人参皂苷R4在制备神经退行性疾病治疗药物中的应用

摘要

本发明提供了越南人参皂苷R4在制备神经退行性疾病治疗药物中的应用，特别是在制备帕金森病治疗药物中的应用。本发明中，通过设计体外帕金森模型，首次提出并证实了越南人参皂苷R4能够降低细胞损伤，通过抑制细胞的氧化应激以及调控细胞凋亡，从而发挥抗帕金森疾病作用。因而，本发明提供了将越南人参皂苷R4作为帕金森疾病有效治疗药物的应用，为开发和扩大越南人参皂苷R4的药物应用提供了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及药物领域，具体而言，涉及越南人参皂苷R4在制备神经退行性疾病治疗药物中的应用，特别是在制备帕金森病治疗药物中的应用。

背景技术

神经退行性疾病是由于神经元或髓鞘的丧失而导致的中枢神经系统发生功能障碍的一种疾病，多发于中老年时期。阿尔兹海默症、帕金森病、亨廷顿氏舞蹈病等均是比较常见的神经退行性疾病。

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是发生于老年人群中排名仅次于阿尔兹海默症的神经退行性疾病，其原因在于黑质中多巴胺能神经元的选择性死亡或缺失以及细胞内路易斯小体的形成。PD疾病的临床特征表现为行动迟缓、姿势步态障碍、静止性震颤、肌强直、步伐拖曳等，部分可出现认知障碍、情绪低落、焦躁不安等症状。这些非运动症状将进一步加重患者的痛苦，影响患者的生存质量。

帕金森病的病因尚不清楚，但大量证据表明，其发病过程中涉及多种因素，包括细胞凋亡、衰老、自身免疫、有毒物质、氧化应激和地理环境。其中，多巴胺能神经元变性的最终共同途径是氧化应激，氧化应激是生物体或细胞中氧自由基的产生和消除的不平衡，导致反应性活性氧(reactive oxygen species，ROS)和反应性活性氮(reactive nitrogenspecies，RNS)在体内积累过多而引起的氧化损伤。其中，ROS可引起蛋白质变性，脂质过氧化和基因突变，最终导致神经细胞损伤和凋亡。目前PD的发病率呈逐年上升趋势，是我国乃至全世界亟待解决的主要难题之一。因此，抗帕金森药物开发与利用的重要性不言而喻。

越南人参皂苷R4是从人参叶中提取的一种皂苷类化合物。人参皂苷具有多种药理学活性，如抗氧化、抗衰老、降血脂、提高免疫力、抑制缺血再灌注损伤、降低炎症反应的发生。越南人参皂苷R4属于皂苷类活性成分之一，但越南人参皂苷R4能否对PD疾病损伤的神经元具有神经保护作用，目前国内外尚未见相关报道。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种越南人参皂苷R4在制备神经退行性疾病治疗药物中的应用。

本发明的第二目的在于提供一种用于神经退行性疾病治疗的药物组合物。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

越南人参皂苷R4在制备神经退行性疾病治疗药物中的应用。

同时，本发明还提供了一种用于神经退行性疾病治疗的药物组合物，所述药物组合物中包含越南人参皂苷R4。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)本发明中，通过设计体外帕金森模型，首次提出并证实了越南人参皂苷R4能够降低细胞损伤，通过抑制细胞的氧化应激以及调控细胞凋亡，从而发挥抗帕金森疾病作用。因而，本发明提供了将越南人参皂苷R4作为帕金森疾病有效治疗药物的应用，为开发和扩大越南人参皂苷R4的药物应用提供了基础。

2)目前帕金森疾病的发病机制尚不明确，本发明发现细胞凋亡和氧化应激与帕金森疾病的发生密切相关，本发明重点研究细胞凋亡和氧化应激在帕金森疾病中的意义，在以PC12细胞为模型的基础上，分析ROS，Bax、Caspase-3的表达量，并采用不同浓度的越南人参皂苷R4作用于帕金森模型上，研究其神经保护作用与其浓度之间的依赖性关系，为帕金森疾病的治疗筛选有效的药物浓度，并为抗帕金森疾病的药物寻找与制备提供新的研究思路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为越南人参皂苷R4对于正常PC12细胞的毒性结果；

图2为越南人参皂苷R4对6-OHDA诱导的PC12细胞的保护作用；

图3为越南人参皂苷R4作用于6-OHDA诱导后PC12细胞的形态变化图；其中，(a)正常对照组，(b)6-OHDA处理组，(c)100μm R4+250μm6-OHDA组；

图4为越南人参皂苷R4对6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡率的影响；

图5为越南人参皂苷R4对6-OHDA引起氧化应激的影响；

图6为越南人参皂苷R4对6-OHDA引起NF-κB表达量的影响；

图7为越南人参皂苷R4对PC12细胞内的Bax和Caspase-3蛋白表达量的影响。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

虽然有研究表明，人参皂苷Rg1、Re以及F1等皂苷类化合物具有一定的抗帕金森病作用，然而，对于越南人参皂苷R4的药用研究，特别是其在帕金森病等神经退行性疾病中的作用，还没有相关的研究报道。有鉴于在越南人参皂苷R4药用领域的研究空白，特提出本发明。

本发明中，是以越南人参皂苷R4为药效物质，进行神经退行性疾病，特别是帕金森病治疗的应用性实验，并通过实验证明越南人参皂苷R4具有抗帕金森病的潜在药用价值。

具体的，本发明中，越南人参皂苷R4的结构为：

本发明中，经细胞诱导模型实验发现，越南人参皂苷R4具有抗帕金森病的功效。越南人参皂苷R4可以通过降低由帕金森病所导致细胞损伤(特别是对于由帕金森病导致的受损细胞具有神经保护功能)，以及抑制由帕金森病所导致的细胞氧化应激，和减少由帕金森病所导致细胞死亡等作用，起到帕金森病治疗的药用作用。

进一步的，实验研究还发现，越南人参皂苷R4还具有抑制由帕金森病所引发的NF-κB p65入核表达，以及抑制由帕金森病所引发的Caspase-3蛋白表达和Bax基因表达的效果，这有望成为帕金森疾病治疗的新的切入点。

基于越南人参皂苷R4在帕金森病治疗中的药用作用，本发明还提供了一种神经退行性疾病治疗用药物组合物，特别是帕金森病治疗用药物组合物。

具体的，本发明所提供的药物组合物除包含越南人参皂苷R4作为功能物质外，还包括药学上可接受的辅料。为了达到复合治疗效果，本发明药物组合物还可以包括除越南人参皂苷R4外的第二药物功能组分。

在本发明的一些实施方式中，为了便于药物组合物的施用，还可以将包含越南人参皂苷R4的药物组合物制备成不同的药用剂型，特别是口服剂和注射剂；

在本发明优选的一些实施方式中，所述口服剂包括：片剂，颗粒剂，滴丸，软胶囊，悬浮剂，溶液剂，以及糖浆中的至少一种；

其中，对于片剂、颗粒级、滴丸，以及软胶囊等固体口服制剂，其除了包含越南人参皂苷R4作为药效物质外，还可以包含至少一种惰性的可药用辅料，所述辅料包括：a)填料或增量剂，比如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘合剂，例如羧基甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶，c)保湿剂，比如甘油，d)崩解剂，比如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、硅酸盐和碳酸钠，e)溶液阻滞剂，比如石蜡，f)吸收加速剂，比如季铵化合物，g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂，比如高岭土和膨润土，和i)润滑剂，比如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，及其混合物；

对于悬浮剂，溶液剂以及糖浆剂等液体口服制剂，其除了包含越南人参皂苷R4作为药效物质外，还可以包含至少一种本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，比如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，及其混合物；以及湿润剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂和芳香剂等辅料。

在本发明优选的一些实施方式中，所述注射剂包括：冻干粉剂，溶液型注射剂，混悬型注射剂，以及乳剂型注射剂中的至少一种；

其中，对于冻干粉剂，其除了包含越南人参皂苷R4作为药效物质外，还至少含有一种常用的冻干赋型剂，例如：葡萄糖、乳糖等糖类，甘露醇、山梨醇等多元醇类，甘氨酸、谷氨酸等氨基酸类，氯化钠、氯化钾、氯化钙等无机盐类，以及明胶等大分子类冻干赋型剂。

其中，对于溶液型注射剂，混悬型注射剂，以及乳剂型注射剂等液体注射剂，其除了包含南人参皂苷R4作为药效物质外，还至少含有一种分散剂或润湿剂和助悬剂等辅料。

在下面的具体实施例中，本发明通过以下实验证明越南人参皂苷R4(下简称R4)对帕金森病(下简称PD)具有较好的神经保护作用，能够有效缓解PD的多种病理学变化：

在体外利用6-羟基多巴胺(下简称6-OHDA)诱导PC12细胞设计产生帕金森样综合症。通过检测PC12细胞存活率、细胞形态观察，凋亡相关因子表达、氧化应激相关参数测定，研究发现R4预处理显著减弱了PC12细胞中6-OHDA诱导的神经毒性和细胞凋亡。通过western blot技术检测核因子NF-κB p65的表达量。此外，通过该方法探索R4对6-OHDA所引起的促凋亡因子Bax和凋亡执行蛋白Caspase-3表达的影响最终研究发现R4通过NF-κB介导的凋亡途径发挥神经保护作用。

其中，所用R4为专利申请人从人参叶中提取分离获得，结构通过核磁共振技术给予确认，与市售CAS编号为：156009-80-2的商品和核磁结果相符。

以下各组实验中，所有的数据均采用SPSS ver.19.0软件进行统计学分析。数据以平均值±标准差(x±s)表示。采用单因素方差分析与t检验分析是实验组与对照组、实验组与实验组之间的差异。当p<0.05时，认为差异具有显著性。

实施例1 MTT法检测R4对于正常PC12细胞的毒性作用

实验材料：大鼠嗜铬细胞瘤PC12购于美国菌种保藏中心(ATCC)

实验步骤：将处于对数期的PC12细胞以0.25％胰酶-EDTA消化，结束后加入辅以10％胎牛血清，5％马血清，100μg/mL链霉素，和100units/mL盘尼西林的高糖DMEM培养基将细胞吹打至单个细胞；重悬后，以3×10⁵细胞/mL接种于96-平板中，按照不同的实验组进行加药处理。其中，空白组是不含有PC12细胞的DMEM完全培养基；对照组是不含有R4和6-OHDA的细胞培养液；实验组是分别加入6.25，12.5，25，50，100，200μM>

各组培养液在CO₂培养箱培养24h，以真空压力泵吸除细胞培养液，加入以终浓度为0.5mg/mL的MTT储备液100μL，继续放入CO₂培养箱孵育4h后，加入等体积的MTT终止液，继续培养16-20h后，采用酶标仪在波长为550nm处测定每孔的吸光度，并按照公式计算出细胞的存活率。计算公式为：

细胞存活率＝(A_实验组-A_空白组)/(A_对照组-A_空白组)×100％，A为检测波长为550nm处的吸光度。

实验结果如图1所示，由图1结果可知，在6.25-200μM的R4处理细胞后，细胞存活率均在92％以上，说明R4对PC12细胞均无显著性毒性。

实施例2 MTT法检测R4对6-OHDA诱导的PC12细胞活力的影响

实验步骤：将处于对数期的细胞以3×10⁵细胞/mL接种于96-平板中，培养24h。设立对照组、空白组、250μM>

实验结果如图2所示，由图2可知，6-OHDA处理组细胞存活率为58.76％，相比于6-OHDA处理组，不同浓度的R4预处理组的细胞存活率明显上升，分别达到70.81％，78.74％和80.88％，且具有浓度依赖性关系。由此可见，R4预处理可以显著减少细胞死亡率。

实施例3 R4对6-OHDA诱导的PC12细胞形态的影响

实验步骤：采用扫描电子显微镜(SEM)观察6-OHDA诱导的PC12细胞形态，细胞分组设置：正常对照组，250μM 6-OHDA处理组，250μM 6-OHDA+25μM R4处理组，250μM 6-OHDA+50μM R4处理组，250μM 6-OHDA+100μM R4处理组。细胞药物处理结束后，以2.5％的戊二醛固定液固定细胞，在培养箱中孵育1h，以PBS溶液洗涤细胞3次，每次5min，最后使用30％、50％、70％、90％、100％的乙醇梯度洗脱洗细胞2次，每次5min。取处理好的细胞，并在SEM下观察其细胞形态。

实验结果见图3所示，由图3(a)(正常对照组)结果可知，正常的PC12细胞具有突起，细胞之间彼此紧密连接，形成网络状结构；同时，由图3(b)(6-OHDA处理组)结果可知，在经6-OHDA处理后，细胞突起消失，成为独立单个细胞；进一步的，由图3(c)(100μm R4+250μm6-OHDA组)结果可知，R4药物预处理后，细胞状态得到很大的改善。由此可见，R4对受损PC12细胞具有明显的神经保护功能。

实施例4 R4对6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡的影响

实验步骤：将处于对数生长期的PC12细胞以3×10⁵cells/孔接种于6孔板中，药物处理过程如实施例3所述。药物处理后，将每孔的细胞进行胰酶消化，室温下以1800rpm的离心速度离心3min后收集PC12细胞。然后以100μl的1×binding>

结果见图4，由图4结果可知，正常对照组细胞的凋亡率为7.35％，6-OHDA诱导后，细胞受损，细胞凋亡率升高至36.97％，给予药物R4预处理后，细胞的凋亡率随着R4加入浓度的增加而减少，当R4加入浓度分别为25，50，100μM时，细胞的凋亡率分别减少至33％，22.6％，16.2％。由此可见，R4可明显降低受损PC12细胞的凋亡率。

实施例5 R4对6-OHDA诱导PC12细胞引起氧化应激的影响

氧化应激是指有机体或细胞内受到外来刺激时，体内的活性氧自由基ROS和RNS在体内过量积累，抗氧化系统防御水平下降，最终导致体内组织受损。因此，ROS可以双向调节细胞凋亡和细胞增殖，细胞信号转导和ROS之间存在着内在联系。通过测定细胞体内ROS含量，进而考察R4对6-OHDA诱导PC12细胞引起氧化应激的影响。

按照实施例3方法设置不同实验组，并分别进行药物处理，然后利用DCFH-DA荧光染色法在流式细胞仪下检测细胞内的ROS水平。结果如图5所示。由图5结果可知，与正常对照组相比，6-OHDA单独处理组的ROS平均荧光强度是对照组的3.595倍。当用R4和6-OHDA共同处理后，细胞体内的ROS水平降低，分别为2.989倍、2.111倍和1.703倍，可见ROS在体内的动态平衡与R4的神经保护作用具有重要的联系。

实施例6 R4对6-OHDA引发PC12细胞的NF-κB的影响

药物处理过程及其分组情况如实施例3所详述。细胞处理结束后，使用核蛋白/胞浆蛋白提取试剂盒提取细胞核蛋白后，Bradford法对蛋白进行定量，western blot测其细胞核内NF-κB亚基p65的积累量。

实验结果如图6所示，由图6结果可知，在正常对照组中，NF-κB p65的表达量较低，但是6-OHDA诱导PC12细胞后，细胞核内NF-κB p65的积累量明显增多，说明6-OHDA可引起NF-κB的核移位。不同浓度R4预处理后，核移位现象显著减弱，并且具有剂量依赖性关系。因此，R4能够抑制由6-OHDA所引起的NF-κB p65入核表达的作用。

实施例7 R4对PC12细胞的Bax和Caspase-3蛋白表达的影响

采用western blot技术检测细胞内Bax和Caspase-3蛋白表达量的变化情况，并以β-actin作为标准内参蛋白。在众多凋亡调节基因中，Bcl-2家族的表达对细胞凋亡至关重要，其中促凋亡基因Bax和抗凋亡Bcl-2对确定细胞是否发生凋亡具有重要意义。Caspase级联反应是细胞凋亡的基石，Caspase激活一个特定的信号系统，导致核皱缩和DNA分裂,最终控制细胞凋亡的发生和发展。

药物处理过程及其分组情况如实施例3所详述。药物处理后收集细胞提取细胞总蛋白，在western blot下检测细胞的Bax和Caspase-3蛋白表达量。

实验结果如图7所示，由图7结果可知，6-OHDA诱导细胞后，细胞内的凋亡执行蛋白Caspase-3和促凋亡基因Bax表达量明显上升，而给予R4预处理后，两者表达量均有所降低，并且具与浓度依赖性关系，R4浓度越高，Caspase-3和Bax的表达量恢复的越高。由如上实验结果可以得知，R4是通过下调Bax和Caspase-3蛋白质的表达量，进而调控细胞凋亡，发挥神经保护作用。

由如上实施例1-7的实验结果可知，R4能够降低6-OHDA所引起的ROS的堆积，减小了氧化应激反应。在以R4进行预处理后，细胞凋亡率降低，NF-κB发生核移位的行为减少，更加能够证实R4对于6-OHDA所诱导PC12细胞产生的帕金森模型具有显著的神经保护作用，而NF-κB所介导的凋亡反应参与了R4的神经保护作用，而这也为R4作为抗PD治疗剂的应用提供了理论依据。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。