一种酶活提高的青霉素酶突变体及其构建方法

摘要

本发明涉及一种酶活提高的青霉素酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明酶活提高的青霉素酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明采用单点突变技术，基于同源建模方法，通过选择特定氨基酸优化青霉素酶分子结构、提高酶活，对于满足青霉素酶工业化成产需求和降低生产成本有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶活提高的青霉素酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

自1929年青霉素发明以来，抗生素在防治细菌性疾病方面，发挥了巨大的作用。但是，由于抗生素的长期大量使用，特别是不规范地滥用抗生素，导致了日益严重的细菌耐药性问题。细菌耐药最主要的机制是产生灭活酶，如β-内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶等。β-内酰胺酶能够与β-内酰胺的羧基共价结合，使其酰胺键水解，灭活青霉素和/或头孢菌素。β-内酰胺酶种类较为复杂，到目前已发现有三百多种，并且由于超广谱β-内酰胺类抗生素的大量使用，出现了耐受超广谱β-内酰胺类抗生素的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)。根据末端氨基酸序列及编码基因的位点可将β-内酰胺酶分成A、B、C和D四类：SHV属于A类，金属酶属于B类，AmpC酶属于C类，0XA型酶属于D类。A型和D型酶属于青霉素酶；C型酶属于头孢菌素酶；B型酶依靠金属离子而保持活性，因此被称为金属酶。

A型β-内酰胺酶的代表酶是TEM型酶和SHV型酶，它们能分解青霉素类药物，而对头孢菌素类药物的水解能力低。A型酶可被克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦等酶抑制剂所抑制。

D型β-内酰胺酶的特点是能分解其它几乎不能被β-内酰胺酶分解的oxacillin等青霉素类药物，被称为OXA型酶。此型酶多数分离自绿脓杆菌，其亚型也很多。克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦等对此型酶有很强的抑制作用。

超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)作为β-内酰胺类药物耐药的主要机制，通过破坏β-内酰胺环使得抗菌药物的分子抗菌性失活，继而引发耐药菌株的产生。ESBLs主要包括以下几种类型，以SHV型、TEM型、CTX-M型最为常见，其余各型包括PER型、GES型、BES型、VEB型等，各酶型间的流行分布及水解活性存在一定差异。SHV型β-内酰胺酶作为早期发现的代表酶型之一，其耐药基因大多由质粒介导传播。自1983年在德国报道了首例SHV型ESBL以来，截至2016年底，全球范围内已被公布的SHV型变异体已达180多种，且在医院获得性或社区感染性微生物中广泛传播。

SHV型β-内酰胺酶属于A类丝氨酸类β-内酰胺酶，是最早发现、且最为流行的酶型之一。1972年，首次在德国的一株大肠埃希菌中发现了SHV-1型β-内酰胺酶，SHV-1源性酶以点突变的方式影响其表达的1-5个氨基酸发生替换，逐渐扩大了酶蛋白的底物谱。1983年，在一株耐头孢噻肟的臭鼻克雷伯菌中发现了一种SHV型ESBL，命名为SHV-2，此为第一个发现的SHV型超广谱β-内酰胺酶。研究发现，与SHV-1相比，SHV-2仅在第238位发生了Gly238Ser氨基酸突变，而这种单一氨基酸的取代改变了SHV-1型酶的活性，耐药谱上则拓宽了对第三代头孢类药物的水解活性。此后，SHV型ESBLs变异体逐渐出现，如SHV-2a型、SHV-3型、SHV-4型、SHV-5型、SHV-12型等。

GMP中规定无菌药品(包括生物制品)的无菌生产工艺必须采用环境监测来评估生产环境控制是否达到GMP要求。监控项目包括空气悬浮粒子、空气浮游菌、沉降菌、设施和设备表面的微生物以及操作人员的卫生状况监测等。注射用青霉素类抗生素无菌分装间、功能间属于产尘功能间。青霉素类抗生素粉尘落入监测用培养基平皿中，将降低平皿中培养基灵敏度，进而影响生产过程环境监控数据准确可靠性。监测用培养基平皿中添加青霉素酶的量，以确保环境监测用监测皿培养基灵敏度适用于生产过程环境监控。开发高活性的青霉素酶具有较高的商业价值。

异源表达青霉素酶突出的问题是，蛋白表达量低、青霉素酶活低。因此，定点突变改造青霉素酶，提高胞外酶活，对于满足青霉素酶工业化成产需求和降低生产成本有重要意义。本发明采用单点突变技术，基于同源建模方法，通过选择特定氨基酸优化青霉素酶分子结构、提高酶活。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种酶活提高的青霉素酶突变体及其构建方法，本发明的青霉素酶突变体具有较高的酶活，对于满足青霉素酶工业化成产需求和降低生产成本有重要意义。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种酶活提高的青霉素酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

作为本发明所述青霉素酶突变体的优选实施方式，所述突变体在如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的基础上，将第150位的脯氨酸突变成苏氨酸。

作为本发明所述青霉素酶突变体的优选实施方式，编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。表达核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的青霉素酶的工程菌，为发明人之前研究所获得。

第二方面，本发明提供了一种酶活提高的青霉素酶突变体基因，所述基因编码上述酶活提高的青霉素酶突变体。

作为本发明所述青霉素酶突变体基因的优选实施方式，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

第三方面，本发明提供了一种工程菌，所述工程菌表达上述酶活提高的青霉素酶突变体。

第四方面，本发明提供了上述工程菌的制备方法，包括以下步骤：在如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的基础上，将第150位的脯氨酸突变成苏氨酸，得到突变体，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到DH5ɑ宿主菌中即得到工程菌。

第五方面，本发明提供了上述酶活提高的青霉素酶突变体在制备青霉素酶中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明采用单点突变技术，基于同源建模方法，通过选择特定氨基酸优化青霉素酶分子结构、提高酶活，对于满足青霉素酶工业化成产需求和降低生产成本有重要意义。

附图说明

图1为青霉素酶突变体工程菌的发酵曲线图。

图2为青霉素酶突变体工程菌破碎裂解后上清的酶SDS-PAGE检测图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1定点突变

以含有SEQ ID NO:4的重组质粒为模板质粒，参照TaKaRa生物产品及操作手册，利用TaKaRa MuTanBEST突变试剂盒，利用设计的相应突变引物对，PCR扩增出BmPGA的定点突变序列，具体操作步骤如下：

(1)突变引物

正向引物BLAA-150-F为5’-GACCTGAACACCGCTATCRHTGGTGACG AACGTGACACC-3’，

反向引物BLAA-150-R为5’-GGTGTCACGTTCGTCACCADYGATAGCGG TGTTCAGGTC-3’。

(2)反应体系(10ul)

10xPfu聚合酶缓冲液10ul，10mmol/L dNTP溶液2ul，正向引物25pmoles，反向引物25pmoles，Pfu DNA聚合酶5U，质粒DNA模板100-200pg，加水至100ul。

(3)PCR条件：94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃300s，30个循环，72℃10min。

参考TAKARA公司操作手册，对PCR获得的DNA片断的5’末端进行磷酸化，然后将磷酸化的突变引物进行自身环化，接着转化DH5α感受态细胞，并涂布于加入卡纳硫酸霉素抗生素的LB选择性平板上，37℃倒置培养约20h。能在加入卡纳硫酸霉素抗生素的LB平板上长出来的就是转化有重组质粒的转化子。最后对转化子进一步培养以对重组质粒进行扩增，并抽提扩增的重组质粒。

对筛选到的突变质粒进行测序，确定所获得的质粒在目的突变位点发生了突变而在非目的突变位点没有发生突变。

实施例2工程菌的获得

参照《分子克隆实验指南》的方法，将突变后的质粒转化大肠杆菌感受态细胞或酵母菌感受态细胞，获得表达突变酶的基因工程菌株，最后将工程菌株涂布于加入硫酸卡那霉素抗生素的LB选择性平板上，37℃倒置培养约12-18h，能在加入硫酸卡那霉素抗生素的LB平板上长出来的就是转化有重组质粒的转化子。

实施例3工程菌发酵培养

从LB选择性培养平板上挑单菌落，接种至3mL的LB液体培养基中，加入卡那霉素，至其终浓度为100μg/mL，于37℃下250r/min培养过夜；取2mL培养过夜的培养液，接种至200mL的LB液体培养基中，于37℃下250r/min培养4-6h，OD600达到1.0-1.6之间，获得种子菌液。按1：15的接种量接入到含有3升TB培养基的5升发酵罐中，在37℃，400rpm，1.3vvm的发酵条件下，发酵培养至OD600达到25时，调节温度为30℃，用终浓度为1％的IPTG诱导，继续培养2小时后，再加入终浓度为0.5％IPTG诱导，再继续培养约14-16小时，发酵结束。

工程菌的发酵曲线图如图1所示，横坐标为时间，纵坐标为OD600数值，数值越高，菌浓越高，收菌时OD600达到90，达到工业化生产的要求。发酵液8000rpm离心20min，收集菌体，-20℃保存。

取1ml发酵培养14-16小时的菌液，12000rpm离心1min，弃上清，然后用1ml 20mM磷酸钾盐(PH7.0)重悬菌体，然后超声破碎细胞，进行SDS-PAGE检测。SDS-PAGE采用Laemmli电泳方法，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为8％，还原样品与上样缓冲液混合后，100℃煮沸5分钟进行上样电泳。

结果如图2所示，青霉素酶的分子量约为25KD，1-B为诱导前取样，1-A为诱导后取样，结果显示诱导后在25KD处出现了阳性条带，表明青霉素酶成功表达。

实施例4突变酶的纯化

量取5mL预处理的亲和载体FP-IDA-Ni2+，装入纯化柱中。样品按照1.0BV/h速度过柱。用3-5BV的Washing缓冲液以1.0BV/h流速去除杂蛋白，同时利用蛋白核酸检测仪在280nm条件下检测流出液的蛋白含量，直到Washing缓冲液澄清以及蛋白核酸检测仪的数值不再变化为止，最后在蛋白核酸检测仪280nm的监控下，用约1-2BV的Elution缓冲液以1-2BV/h的速度洗脱目的酶，酶液4℃保存。

实施例5酶水解活力的测定

1、测定方法

青霉素溶液的制备：称取青霉素钠(钾)适量，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液。

青霉素酶稀释液的制备：取青霉素酶发酵液/纯化后的酶，稀释1000-5000倍，在37℃预热。

测定法：精密量取青霉素溶液50ml，置100ml量瓶中，预热至37℃后，精密加入已预热的青霉素酶稀释液25ml，迅速混匀，在37℃准确放置1小时，精密量取3ml，立即加至已精密量取的碘滴定液(0.005mol/L)[精密量取碘滴定液(0.05mol/L)10ml，置100ml量瓶中，用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度]25ml中，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失。

空白试验：取已预热的青霉素溶液2ml，在37℃放置1小时，精密加入上述碘滴定液(0.005mol/L)25ml，然后精密加青霉素酶稀释液1ml，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。按下式计算：

E＝(B-A)×M×F×D×100

式中，E为青霉素酶活力，单位/(ml·小时)；

B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml；

A为供试品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml；

M为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol/L；

F为在相同条件下，每1ml的上述碘滴定液(0.005mol/L)相当于青霉素的效价，单位；

D为青霉素酶溶液的稀释倍数。

磷酸盐缓冲液(pH7.0)：取磷酸氢二钾7.36g与磷酸二氢钾3.14g，加水使成1000ml。

醋酸钠缓冲液(pH4.5)：取冰醋酸13.86ml，加水使成250ml；另取结晶醋酸钠27.30g，加水使成200ml，两液混合均匀。

2、测试结果

酶水解活力的测试结果如表1所示。由表1可知，突变酶的水解底物的酶活为1.26×10¹⁰U/L.h，相对于原始菌株(2.61×10⁹U/L.h)提高了4.82倍。

表1

菌号氨基酸突变位点相对活力(％)原始菌株——100％青霉素酶P150TP150T482％

实施例6加酶TSA固体培养基制备及灵敏度测试

配制TSA固体培养基，其中胰蛋白胨15.0g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂14g/L，pH值7.5。将配置好的培养基于121℃下高压灭菌25分钟，待其冷却至50℃，加入青霉素酶，混合均匀，使得青霉素酶溶解在TSA培养基中的浓度为30万单位/mL。在超净工作台，将20ml TSA加酶培养基均匀平铺于平皿底板，冷却凝固，盖上平皿上盖。

往皿中加入青霉素类抗生素10mg，按《中国药典》2015年版四部通则1105平皿法中的涂布法进行试验，计算回收率。藤黄微球菌(G+球菌)、皮氏罗尔斯顿菌(G－杆菌)及霉菌的回收率分别为100％、99％、100％。结果显示均有效中和青霉素10mg粉尘，灵敏度满足培养基的适用性试验，适用于青霉素类抗生素日常环境沉降菌监测。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州白云山拜迪生物医药有限公司

<120> 一种酶活提高的青霉素酶突变体及其构建方法

<130> 20181221

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 267

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asn Thr Lys Gly Ile Asp Glu Ile Lys Asn Leu Glu Thr Asp Phe

1 5 1015

Asn Gly Arg Ile Gly Val Tyr Ala Leu Asp Thr Gly Ser Gly Lys Ser

202530

Phe Ser Tyr Arg Ala Asn Glu Arg Phe Pro Leu Cys Ser Ser Phe Lys

354045

Gly Phe Leu Ala Ala Ala Val Leu Lys Gly Ser Gln Asp Asn Arg Leu

505560

Asn Leu Asn Gln Ile Val Asn Tyr Asn Thr Arg Ser Leu Glu Phe His

65707580

Ser Pro Ile Thr Thr Lys Tyr Lys Asp Asn Gly Met Ser Leu Gly Asp

859095

Met Ala Ala Ala Ala Leu Gln Tyr Ser Asp Asn Gly Ala Thr Asn Ile

100 105 110

Ile Leu Glu Arg Tyr Ile Gly Gly Pro Glu Gly Met Thr Lys Phe Met

115 120 125

Arg Ser Ile Gly Asp Glu Asp Phe Arg Leu Asp Arg Trp Glu Leu Asp

130 135 140

Leu Asn Thr Ala Ile Thr Gly Asp Glu Arg Asp Thr Ser Thr Pro Ala

145 150 155 160

Ala Val Ala Lys Ser Leu Lys Thr Leu Ala Leu Gly Asn Ile Leu Ser

165 170 175

Glu His Glu Lys Glu Thr Tyr Gln Thr Trp Leu Lys Gly Asn Thr Thr

180 185 190

Gly Ala Ala Arg Ile Arg Ala Ser Val Pro Ser Asp Trp Val Val Gly

195 200 205

Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly Ala Tyr Gly Thr Ala Asn Asp Tyr Ala

210 215 220

Val Val Trp Pro Lys Asn Arg Ala Pro Leu Ile Ile Ser Val Tyr Thr

225 230 235 240

Thr Lys Asn Glu Lys Glu Ala Lys His Glu Asp Lys Val Ile Ala Glu

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Arg Ser Ile Gly Asp Glu Asp Phe Arg Leu Asp Arg Trp Glu Leu Asp

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Glu His Glu Lys Glu Thr Tyr Gln Thr Trp Leu Lys Gly Asn Thr Thr

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Ala Ser Arg Ile Ala Ile Asp Asn Leu Lys Leu

260 265

<210> 3

<211> 798

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaacacca aaggtatcga cgaaatcaaa aacctggaaa ccgacttcaa cggtcgtata 60

ggtgtgtacg cactggacac cggttctggt aaatctttct cttaccgtgc taatgagagg 120

ttcccgctgt gctcgtcttt caaaggtttc ctggctgctg ctgttctgaa aggttctcag 180

gacaaccgtc tgaacctgaa ccagatcgtt aactacaaca cccgttctct ggaattccac 240

tctccgatca ccaccaaata caaagacaac ggtatgtctc tgggtgacat ggctgctgct 300

gctctgcagt actctgacaa cggtgctacc aacatcatcc tggaacgtta catcggtggt 360

ccggaaggta tgaccaaatt catgcgttct atcggtgacg aagacttccg tctggaccgt 420

tgggaactgg acctgaacac cgctatcact ggtgacgaac gtgacacctc taccccggct 480

gctgttgcta aatctctgaa aaccctggct ctgggtaaca tcctgtctga acacgaaaaa 540

gaaacctacc agacctggct gaaaggtaac accaccggtg ctgctcgtat ccgtgcttct 600

gttccgtctg actgggttgt tggtgacaaa accggttctt gcggtgctta cggtaccgct 660

aacgactacg ctgttgtttg gccgaaaaac cgtgctccgc tgatcatctc tgtttacacc 720

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