蟋蟀草平脐蠕孢菌素I及其制备方法与应用、蟋蟀草平脐蠕孢菌素J及其制备方法与应用

摘要

本发明涉及一种蟋蟀草平脐蠕孢菌素I及其制备方法与应用、蟋蟀草平脐蠕孢菌素J及其制备方法与应用，属于化学化工领域。其中，蟋蟀草平脐蠕孢菌素I的化学结构式为

说明书

技术领域

本发明涉及化学化工领域，且特别涉及一种蟋蟀草平脐蠕孢菌素I及其制备方法与应用、蟋蟀草平脐蠕孢菌素J及其制备方法与应用。

背景技术

马铃薯(学名：Solanum tuberosum L.)，属茄科一年生草本植物，块茎可供食用，是全球第四大重要的粮食作物，仅次于小麦、稻谷和玉米。马铃薯又称地蛋、土豆、洋山芋等，茄科植物的块茎，与小麦、稻谷、玉米、高粱并成为世界五大作物。

一般新鲜马铃薯中所含成分：淀粉9-20％，蛋白质1.5-2.3％，脂肪0.1-1.1％以及粗纤维0.6-0.8％。100g马铃薯中所含的营养成分：能量318千焦，钙5-8mg，磷15-40mg，铁0.4mg-0.8mg，钾200-340mg，碘0.8-1.2，胡萝卜素12-30mg，硫胺素0.03-0.08mg，核黄素0.01-0.04mg以及尼克酸0.4-1.1mg，营养丰富。

中医认为马铃薯“性平味甘无毒，能健脾和胃，益气调中，缓急止痛，通利大便。对脾胃虚弱、消化不良、肠胃不和、脘腹作痛、大便不畅的患者效果显著”。现代研究证明，马铃薯对调解消化不良有特效，是胃病和心脏病患者的良药及优质保健品。并且，马铃薯富有营养，是抗衰老的食物之一。

目前国内外学者对马铃薯的化学成分及其应用研究取得了一定进展，但还需要进一步深入研究。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种蟋蟀草平脐蠕孢菌素I，该蟋蟀草平脐蠕孢菌素I的化学结构式为

本发明的目的之二在于提供一种蟋蟀草平脐蠕孢菌素J，该蟋蟀草平脐蠕孢菌素J的化学结构式为

本发明的目的之三在于提供一种蟋蟀草平脐蠕孢菌素I和蟋蟀草平脐蠕孢菌素J的制备方法，该方法简单、易操作，能够有效地制备纯度较高的蟋蟀草平脐蠕孢菌素I或蟋蟀草平脐蠕孢菌素J。

本发明的目的之四在于提供一种蟋蟀草平脐蠕孢菌素I，其能用于抑制马铃薯早疫病菌链格孢和/或尖孢镰刀菌。

本发明的目的之五在于提供一种蟋蟀草平脐蠕孢菌素J的应用，其能用于抑制马铃薯早疫病菌链格孢。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：

本发明提出一种蟋蟀草平脐蠕孢菌素I，该蟋蟀草平脐蠕孢菌素I的化学结构式为：

本发明提出一种蟋蟀草平脐蠕孢菌素J，该蟋蟀草平脐蠕孢菌素J的化学结构式为：

本发明还提出一种上述蟋蟀草平脐蠕孢菌素I和蟋蟀草平脐蠕孢菌素J的制备方法，包括以下步骤：

发酵蟋蟀草平脐蠕孢菌，用乙酸乙酯对发酵产物进行萃取，将乙酸乙酯萃取液进行第一次正相硅胶柱分离并将第一次正相硅胶柱分离后的第三个洗脱组分进行第二次正相硅胶柱分离，将第二次正相硅胶柱分离后的第二个亚组分进行凝胶柱分离，将凝胶柱分离后的物质进行制备液相色谱纯化，收集含量最高的两个色谱峰组分，得到保留时间在前的蟋蟀草平脐蠕孢菌素J和保留时间在后的蟋蟀草平脐蠕孢菌素I。

其中，第一次正相硅胶柱分离的条件包括：以氯仿和甲醇为洗脱液，按氯仿与甲醇在洗脱液中的浓度梯度为100:0、50:1：20:1、10:1、5:1、1:1以及0:1的比例进行梯度洗脱，每个梯度所用洗脱液的体积为4.5-5.5L，分别得到七个洗脱组分。

第二次正相硅胶柱分离的条件包括：以石油醚和丙酮为洗脱液，石油醚与丙酮的体积比为10-14:1进行等度洗脱，以每180-220mL为一个洗脱阶段，分别得到六个亚洗脱组分。

凝胶柱分离的条件包括：以600mL的甲醇为洗脱液，以Sephadex LH-20为填料进行洗脱。

制备液相色谱纯化的条件包括：以乙腈和水为洗脱液，按乙腈和水的初始浓度为30:70，最终浓度为60:40梯度洗脱20-30min。

本发明还提出了一种上述蟋蟀草平脐蠕孢菌素I的应用，例如可将其用于抑制马铃薯早疫病菌链格孢和/或尖孢镰刀菌。

本发明还提出了一种上述蟋蟀草平脐蠕孢菌素J的应用，例如可将其用于抑制马铃薯早疫病菌链格孢。

本发明较佳实施例提供的蟋蟀草平脐蠕孢菌素I及其制备方法与应用、蟋蟀草平脐蠕孢菌素J及其制备方法与应用的有益效果是：

本发明方案提供的蟋蟀草平脐蠕孢菌素I和蟋蟀草平脐蠕孢菌素J的原料均为天然产物，绿色安全，毒副作用小。并且上述蟋蟀草平脐蠕孢菌素I和蟋蟀草平脐蠕孢菌素J均为首次从蟋蟀草平脐蠕孢菌的发酵产物中分离得到的新物质。

上述蟋蟀草平脐蠕孢菌素I和蟋蟀草平脐蠕孢菌素J均具有一定的抑制马铃薯早疫病菌链格孢的作用。并且，蟋蟀草平脐蠕孢菌素I还能用于抑制尖孢镰刀菌。

此外，本发明较佳实施例提供的蟋蟀草平脐蠕孢菌素I和蟋蟀草平脐蠕孢菌素J的制备方法简单、易操作，能够有效地从蟋蟀草平脐蠕孢菌的发酵产物中制备纯度较高且得率较高的蟋蟀草平脐蠕孢菌素I或蟋蟀草平脐蠕孢菌素J。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本申请试验例1中内生真菌的菌丝在显微镜下的形态图；

图2为本申请试验例1中内生真菌的孢子在显微镜下的形态图；

图3为本申请试验例1中内生真菌的18S rDNA序列分析的分子系统进化树。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对申请的蟋蟀草平脐蠕孢菌素I及其制备方法与应用、蟋蟀草平脐蠕孢菌素J及其制备方法与应用进行具体说明。

本申请提供的蟋蟀草平脐蠕孢菌素I的化学结构式为蟋蟀草平脐蠕孢菌素J的化学结构式为

上述蟋蟀草平脐蠕孢菌素I和蟋蟀草平脐蠕孢菌素J的制备方法例如可以包括以下步骤：发酵蟋蟀草平脐蠕孢菌，用乙酸乙酯对发酵产物进行萃取，将乙酸乙酯萃取液进行第一次正相硅胶柱分离并将第一次正相硅胶柱分离后的第三个洗脱组分进行第二次正相硅胶柱分离，将第二次正相硅胶柱分离后的第二个亚组分进行凝胶柱分离，将凝胶柱分离后的物质进行制备液相色谱纯化，收集含量最高的两个色谱峰组分，得到保留时间在前的蟋蟀草平脐蠕孢菌素J和保留时间在后的蟋蟀草平脐蠕孢菌素I。

其中，乙酸乙酯萃取的次数可以仅为1次，也可以为多次，如2次、3次等，当萃取次数为多次时，用于第一次正相硅胶柱分离的乙酸乙酯萃取液即为每次萃取后所得的乙酸乙酯萃取液的合并液。在一些实施方式中，每次萃取时，所用的乙酸乙酯的体积与乙酸乙酯发酵产物的体积相同。

在一些实施方式中，第一次正相硅胶柱分离的条件包括：以氯仿和甲醇为洗脱液，按氯仿与甲醇在洗脱液中的浓度梯度为100:0、50:1：20:1、10:1、5:1、1:1以及0:1的比例进行梯度洗脱，每个梯度所用洗脱液的体积可以为4.5-5.5L(优选为5L)，分别得到七个洗脱组分。

值得说明的是，上述氯仿与甲醇的浓度梯度并非百分之百限定成100:0、50:1：20:1、10:1、5:1、1:1以及0:1，在实际配置过程中，允许加减100mL的误差。以每个梯度所用洗脱液的体积为5L，氯仿与甲醇的浓度梯度为100:0为例，即在配置过程中，将氯仿的体积设置为4900mL-5100mL均在本申请方案的保护范围内。此外，每个梯度所用洗脱液的体积也允许加减100mL的误差，也即在配置过程中，每个梯度所用的洗脱液的总体积为4900mL-5100mL均在本申请方案的保护范围内。以下有关洗脱液体积均允许一定范围内的误差。

在一些实施方式中，第一次正相硅胶柱分离过程中，洗脱流速可以为140-160mL/min，例如140mL/min、145mL/min、150mL/min、155mL/min或160mL/min等，此外，洗脱流速也可以为140-160mL/min范围内的任意流速值。

在一些实施方式中，第二次正相硅胶柱分离的条件包括：以石油醚和丙酮为洗脱液，石油醚与丙酮的体积比为10-14:1进行等度洗脱，例如石油醚与丙酮的体积比为10:1、11:1、12:1、13:1或14:1等，也可以为10.5:1、11.5:1、12.5:1或13.5:1等，还可以为10-14:1范围内的任一体积比。在一些优选的实施方式中，石油醚与丙酮的体积比保持为12:1。

第二次正相硅胶柱分离过程中，例如可以每180-220mL(优选为200mL)为一个洗脱阶段，分别得到六个亚洗脱组分。

作为可选地，第一次正相硅胶柱分离所用的硅胶为200-300目，和/或第二次正相硅胶柱分离所用的硅胶为200-300目。

在本申请中，第一次正相硅胶柱分离和第二次正相硅胶柱分离可在同一分离柱中进行，也即两次分离过程仅洗脱液以及洗脱条件不同。此外，也可分别在两个不同的分离柱中进行。

在一些实施方式中，凝胶柱分离的条件包括：以600mL的甲醇为洗脱液，以Sephadex LH-20为填料进行洗脱。

在一些实施方式中，制备液相色谱纯化的条件包括：以乙腈和水为洗脱液，按乙腈和水的初始浓度为30:70，最终浓度为60:40梯度洗脱20-30min，此过程直接通过在制备型液相色谱程序中设置即可。

作为可选地，制备液相色谱纯化过程中，洗脱流速可以为8-12mL/min，如8mL/min、8.5mL/min、9mL/min、9.5mL/min、10mL/min、10.5mL/min、11mL/min、11.5mL/min或12mL/min等，优选为10mL/min。

作为可选地，制备液相色谱纯化过程中，进样量例如可以为80-120μL(优选为100μL)，柱温设置为25-27℃(优选为26℃)。

制备液相色谱纯化过程中，色谱图中出现两个最为明显的色谱峰，也即含量最高的两个色谱峰，其中，保留时间在前(先出峰)的为蟋蟀草平脐蠕孢菌素J，保留时间在后(后出峰)的为蟋蟀草平脐蠕孢菌素I。作为参考地，按上述方式，蟋蟀草平脐蠕孢菌素J的保留时间为16.7min左右，蟋蟀草平脐蠕孢菌素I的保留时间为18.3min左右。

在本申请中，蟋蟀草平脐蠕孢菌可以为现有技术中涉及的蟋蟀草平脐蠕孢菌，也可以按照以下方式分离纯化而得。

优选地，本申请中的蟋蟀草平脐蠕孢菌从马铃薯中分离得到，其获得方法包括以下步骤：以马铃薯为原料在培养基中培养以使培养基中长出菌落，分离并纯化菌落。

其中，马铃薯为云南农业大学薯类研究所提供的分别采自于云南省德宏、大理和临沧三地，新鲜健康，无明显病虫害的马铃薯。

将马铃薯原料于不同的培养基中培养，判断哪个培养基中能够长出目标菌种。具体地，在纯净自来水下，将采摘的马铃薯健康植株的根、茎、叶和块茎清洗干净，擦干，将根、茎和块茎剪切成2-4cm的小段，叶剪成(2-4)cm×(2-4)cm的小片，然后按下列步骤进行表面灭菌：在超净工作台上(无菌条件下)，各分离部位使用75wt％乙醇漂洗1min，无菌水冲洗3次；采用2wt％次氯酸钠灭菌(灭菌时间：根3min，茎2.5min，叶2min，块茎1.5min)或者0.1wt％升汞灭菌(灭菌时间：根40s，茎30s，叶20s，块茎10s)，无菌水漂洗3次；然后放置于无菌滤纸上将水分吸干。经表面灭菌后剪去根、茎和块茎的表面切口，剩余的部分从中间切开，并剪成0.3-0.5cm³的小块进行接种培养，叶四周剪去后将剩余部分剪成(0.2-0.4)cm×(0.2-0.4)cm小块进行接种培养。

接种培养所用的不同的培养基包括水琼脂(无营养)培养基、普通培养基、改良PDA培养基、Peter培养基以及BPA(肉汁胨)培养基。

其中，水琼脂(无营养)培养基的制备方法包括：取琼脂粉20g，去离子水1000mL，加热煮沸，待琼脂融化后进行分装，121℃下高压蒸汽灭菌15-20min。

普通培养基的制备方法包括：取葡萄糖1.0g，猪肉蛋白胨0.03g，磷酸二氢钾0.01g，酵母粉0.1g，无水硫酸镁0.01g，琼脂粉20g，去离子水1000mL，加热煮沸，待琼脂融化后进行分装，121℃下高压蒸汽灭菌15-20min。

改良PDA培养基的制备方法包括：去皮马铃薯200g(切片，稍厚)，去离子水1000mL，加热煮沸20min，双层纱布过滤去渣，滤液补足去离子水至1000mL，加入葡萄糖20g，无水硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3.0g，猪肉蛋白胨1.0g，琼脂粉20g，维生素B₁10mg，加热溶解，用柠檬酸调pH至6.0-6.5，分装后121℃下高压蒸汽灭菌15-20min。

Peter培养基的制备方法包括：葡萄糖20g，酵母浸出粉3.0g，麦芽浸出粉3.0g，蛋白胨5.0g，琼脂粉20g，去离子水1000mL，加热溶解，用柠檬酸调pH至7.2-7.4，分装后121℃下高压蒸汽灭菌15-20min。

BPA(肉汁胨)培养基的制备方法包括：取牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，葡萄糖10g，琼脂20g，去离子水1000mL，加热溶解，用柠檬酸调pH至7.2，分装后121℃下高压蒸汽灭菌15-20min。

通过于22-25℃恒温培养箱(此处恒温培养是指恒温的温度可设置为22-25℃范围内的任一温度值)中培养培养，仅改良PDA培养基能够长出可能是目标菌种的菌种。

进一步地，当观察到马铃薯各个不同的组织内部向改良PDA培养基四周长出肉眼可见的菌落时，根据菌落形态、颜色及长出时间，挑取差异明显的单菌落于新的改良PDA培养基中进行纯化培养。采用顶端菌丝纯化法，接种在新的改良PDA培养基上的马铃薯植株片段需要定期观察其内生真菌长出情况，待内生真菌长出后挑取切口处新长出的菌丝顶端部分，转接到新的PDA培养基上，不断纯化培养，直至获得内生真菌纯菌株。

采用斜面低温保藏法。将纯化后的纯菌株每一株活化3株接种到斜面试管培养基上，置于22-25℃恒温培养箱中培养。待内生真菌长满整个斜面上后，放置于4℃冰箱保存，保藏时间为3-6个月。

进一步地，蟋蟀草平脐蠕孢菌的发酵包括：将蟋蟀草平脐蠕孢菌于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基中第一次培养，然后转入含有马铃薯葡萄糖(PDA)的液体发酵培养基中第二次培养。

其中，第一次培养可以于23-25℃的条件下培养8-12天。第二次培养可以于27-29℃的条件下培养1-3天，然后再于24-26℃的条件下培养19-21天。在一些实施方式中，第二次培养过程中均于转速为150-170r/min的条件下进行。

值得说明的是，为了减少萃取剂的用量以及缩短萃取时间，萃取前可浓缩蟋蟀草平脐蠕孢菌发酵液。

此外，本申请还提供了一种上述蟋蟀草平脐蠕孢菌素I及蟋蟀草平脐蠕孢菌素J的应用，其中，蟋蟀草平脐蠕孢菌素I可用于抑制马铃薯早疫病菌链格孢和/或尖孢镰刀菌，蟋蟀草平脐蠕孢菌素J可用于抑制马铃薯早疫病菌链格孢。

实施例1

将云南农业大学薯类研究所提供的马铃薯健康植株的根、茎、叶和块茎在纯净自来水下清洗干净，擦干，将根、茎和块茎剪切成3cm的小段，叶剪成3cm×3cm的小片，然后按下列步骤进行表面灭菌：在超净工作台上(无菌条件下)，各分离部位使用75wt％乙醇漂洗1min，无菌水冲洗3次；采用2wt％次氯酸钠灭菌(灭菌时间：根3min，茎2.5min，叶2min，块茎1.5min)，无菌水漂洗3次；然后放置于无菌滤纸上将水分吸干。经表面灭菌后剪去根、茎和块茎的表面切口，剩余的部分从中间切开，并剪成0.4cm³的小块进行接种培养，叶四周剪去后将剩余部分剪成0.3cm×0.3cm小块进行接种培养。接种培养所用的不同的培养基包括水琼脂(无营养)培养基、普通培养基、改良PDA培养基、Peter培养基以及BPA(肉汁胨)培养基。接种培养是于温度为24℃的恒温培养箱中培养。

当观察到马铃薯各个不同的组织内部向改良PDA培养基四周长出肉眼可见的菌落时，挑取差异明显的单菌落于新的改良PDA培养基中进行纯化培养，然后采用顶端菌丝纯化法不断纯化培养，直至获得内生真菌纯菌株(蟋蟀草平脐蠕孢菌)。

将蟋蟀草平脐蠕孢菌于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中在24℃的条件下第一次培养10天，然后转入装有100mL的PDA营养液的500nL规格的发酵摇瓶中，在28℃以及160r/min的条件下悬摇2天然后按照每取25mL上述摇瓶发酵后的发酵液25mL转入装有250mL规格的发酵摇瓶中的方式，共转入120瓶，并将120瓶接种摇瓶均于25℃以及160r/min的条件下摇床培养20天。

取20L上述摇床培养后的蟋蟀草平脐蠕孢菌发酵液，浓缩至3L后，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，浓缩，得到18g浸膏。

将上述浸膏用54g正相硅胶拌样后进行第一次正相硅胶柱分离并将第一次正相硅胶柱分离后的第三个洗脱组分(1.2g)进行第二次正相硅胶柱分离，将第二次正相硅胶柱分离后的第二个亚组分(90mg)进行凝胶柱分离，将凝胶柱分离后的物质进行制备液相色谱纯化，收集含量最高的两个色谱峰组分，得到保留时间为16.7min的蟋蟀草平脐蠕孢菌素J(3.5mg)和保留时间为18.3mg的蟋蟀草平脐蠕孢菌素I(4.2mg)。

其中，第一次正相硅胶柱分离的条件包括：以200目的硅胶为填料，以氯仿和甲醇为洗脱液，按氯仿与甲醇在洗脱液中的浓度梯度为100:0、50:1：20:1、10:1、5:1、1:1以及0:1的比例进行梯度洗脱，每个梯度所用洗脱液的体积可以为5L，洗脱流速为150mL/min，分别得到七个洗脱组分。

第二次正相硅胶柱分离的条件包括：以200目的硅胶为填料，以石油醚和丙酮为洗脱液，石油醚与丙酮的体积比为12:1进行等度洗脱，洗脱液共计使用1.2L，分别得到六个亚洗脱组分。

凝胶柱分离的条件包括：以600mL的甲醇为洗脱液，以Sephadex LH-20为填料进行洗脱。

制备液相色谱纯化的条件包括：以乙腈和水为洗脱液，按乙腈和水的初始浓度为30:70，最终浓度为60:40梯度洗脱30min，洗脱流速为10mL/min，进样量为100μL，柱温为26℃。

实施例2

将云南农业大学薯类研究所提供的马铃薯健康植株的根、茎、叶和块茎在纯净自来水下清洗干净，擦干，将根、茎和块茎剪切成2cm的小段，叶剪成2cm×2cm的小片，然后按下列步骤进行表面灭菌：在超净工作台上(无菌条件下)，各分离部位使用75wt％乙醇漂洗1min，无菌水冲洗3次；采用0.1wt％升汞灭菌(灭菌时间：根40s，茎30s，叶20s，块茎10s)，无菌水漂洗3次；然后放置于无菌滤纸上将水分吸干。经表面灭菌后剪去根、茎和块茎的表面切口，剩余的部分从中间切开，并剪成0.3cm³的小块进行接种培养，叶四周剪去后将剩余部分剪成0.2cm×0.2cm小块进行接种培养。接种培养所用的不同的培养基包括水琼脂(无营养)培养基、普通培养基、改良PDA培养基、Peter培养基以及BPA(肉汁胨)培养基。接种培养是于温度为22℃的恒温培养箱中培养。

当观察到马铃薯各个不同的组织内部向改良PDA培养基四周长出肉眼可见的菌落时，挑取差异明显的单菌落于新的改良PDA培养基中进行纯化培养，然后采用顶端菌丝纯化法不断纯化培养，直至获得内生真菌纯菌株(蟋蟀草平脐蠕孢菌)。

将蟋蟀草平脐蠕孢菌于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中在23℃的条件下第一次培养12天，然后转入装有100mL的PDA营养液的500nL规格的发酵摇瓶中，在27℃以及150r/min的条件下悬摇3天然后按照每取25mL上述摇瓶发酵后的发酵液25mL转入装有250mL规格的发酵摇瓶中的方式，共转入120瓶，并将120瓶接种摇瓶均于24℃以及150r/min的条件下摇床培养21天。

取20L上述摇床培养后的蟋蟀草平脐蠕孢菌发酵液，浓缩至3L后，用等体积的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，浓缩，得到浸膏。

将上述浸膏用正相硅胶拌样后进行第一次正相硅胶柱分离并将第一次正相硅胶柱分离后的第三个洗脱组分进行第二次正相硅胶柱分离，将第二次正相硅胶柱分离后的第二个亚组分进行凝胶柱分离，将凝胶柱分离后的物质进行制备液相色谱纯化，收集含量最高的两个色谱峰组分，得到保留时间为16.7min的蟋蟀草平脐蠕孢菌素J和保留时间为18.3mg的蟋蟀草平脐蠕孢菌素I。

其中，第一次正相硅胶柱分离的条件包括：以250目的硅胶为填料，以氯仿和甲醇为洗脱液，按氯仿与甲醇在洗脱液中的浓度梯度为100:0、50:1：20:1、10:1、5:1、1:1以及0:1的比例进行梯度洗脱，每个梯度所用洗脱液的体积可以为4.5L，洗脱流速为140mL/min，分别得到七个洗脱组分。

第二次正相硅胶柱分离的条件包括：以250目的硅胶为填料，以石油醚和丙酮为洗脱液，石油醚与丙酮的体积比为10:1进行等度洗脱，洗脱液共计使用1.08L，分别得到六个亚洗脱组分。

凝胶柱分离的条件包括：以600mL的甲醇为洗脱液，以Sephadex LH-20为填料进行洗脱。

制备液相色谱纯化的条件包括：以乙腈和水为洗脱液，按乙腈和水的初始浓度为30:70，最终浓度为60:40梯度洗脱20min，洗脱流速为8mL/min，进样量为80μL，柱温为25℃。

实施例3

将云南农业大学薯类研究所提供的马铃薯健康植株的根、茎、叶和块茎在纯净自来水下清洗干净，擦干，将根、茎和块茎剪切成4cm的小段，叶剪成4cm×4cm的小片，然后按下列步骤进行表面灭菌：在超净工作台上(无菌条件下)，各分离部位使用75wt％乙醇漂洗1min，无菌水冲洗3次；采用2wt％次氯酸钠灭菌(灭菌时间：根3min，茎2.5min，叶2min，块茎1.5min)，无菌水漂洗3次；然后放置于无菌滤纸上将水分吸干。经表面灭菌后剪去根、茎和块茎的表面切口，剩余的部分从中间切开，并剪成0.5cm³的小块进行接种培养，叶四周剪去后将剩余部分剪成0.4cm×0.4cm小块进行接种培养。接种培养所用的不同的培养基包括水琼脂(无营养)培养基、普通培养基、改良PDA培养基、Peter培养基以及BPA(肉汁胨)培养基。接种培养是于温度为25℃的恒温培养箱中培养。

当观察到马铃薯各个不同的组织内部向改良PDA培养基四周长出肉眼可见的菌落时，挑取差异明显的单菌落于新的改良PDA培养基中进行纯化培养，然后采用顶端菌丝纯化法不断纯化培养，直至获得内生真菌纯菌株(蟋蟀草平脐蠕孢菌)。

将蟋蟀草平脐蠕孢菌于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中在25℃的条件下第一次培养8天，然后转入装有100mL的PDA营养液的500nL规格的发酵摇瓶中，在29℃以及170r/min的条件下悬摇1天然后按照每取25mL上述摇瓶发酵后的发酵液25mL转入装有250mL规格的发酵摇瓶中的方式，共转入120瓶，并将120瓶接种摇瓶均于26℃以及170r/min的条件下摇床培养19天。

取20L上述摇床培养后的蟋蟀草平脐蠕孢菌发酵液，浓缩至3L后，用等体积的乙酸乙酯萃取1次，浓缩萃取液，得到浸膏。

将上述浸膏用正相硅胶拌样后进行第一次正相硅胶柱分离并将第一次正相硅胶柱分离后的第三个洗脱组分进行第二次正相硅胶柱分离，将第二次正相硅胶柱分离后的第二个亚组分进行凝胶柱分离，将凝胶柱分离后的物质进行制备液相色谱纯化，收集含量最高的两个色谱峰组分，得到保留时间为16.7min的蟋蟀草平脐蠕孢菌素J和保留时间为18.3mg的蟋蟀草平脐蠕孢菌素I。

其中，第一次正相硅胶柱分离的条件包括：以300目的硅胶为填料，以氯仿和甲醇为洗脱液，按氯仿与甲醇在洗脱液中的浓度梯度为100:0、50:1：20:1、10:1、5:1、1:1以及0:1的比例进行梯度洗脱，每个梯度所用洗脱液的体积可以为5.5L，洗脱流速为160mL/min，分别得到七个洗脱组分。

第二次正相硅胶柱分离的条件包括：以300目的硅胶为填料，以石油醚和丙酮为洗脱液，石油醚与丙酮的体积比为14:1进行等度洗脱，洗脱液共计使用1.32L，分别得到六个亚洗脱组分。

凝胶柱分离的条件包括：以600mL的甲醇为洗脱液，以Sephadex LH-20为填料进行洗脱。

制备液相色谱纯化的条件包括：以乙腈和水为洗脱液，按乙腈和水的初始浓度为30:70，最终浓度为60:40梯度洗脱25min，洗脱流速为12mL/min，进样量为120μL，柱温为27℃。

试验例1

重复实施实施例1-3，采用真菌学插片培养法观察实施例1-3纯化后所得的内生真菌的菌丝和孢子形态。将内生真菌接种于PDA培养皿中，在靠近培养皿边缘1/3处45°斜插一个经过灭菌的盖玻片，置于25℃恒温培养箱中倒置培养4d，待菌丝长至盖玻片上时，取出放置于载玻片上至显微镜上观察菌丝形态。通过观察，该内生真菌在PDA培养基上生长较快，培养4天呈现黑褐色的菌落，直径4.2cm，背面黑褐色至黑色，其气生菌丝较发达，菌丝在显微镜下的照片如图1所示。

将内生真菌接种于产孢培养基上，诱导产生孢子后，至显微镜上观察孢子形态，其结果如图2所示。其中，产孢培养基为OA(燕麦琼脂)促孢培养基，其制备方法包括：取燕麦片30g，去离子水1000mL，在60℃下水浴加热1h，双层纱布过滤去渣，滤液补足去离子水至1000mL，琼脂粉20g，加热煮沸，待琼脂融化后进行分装，121℃下高压蒸汽灭菌20min。

参照《真菌鉴定手册》、真菌分类学等方法，对纯化后的上述内生真菌采用Ainsworth等分类系统进行初步分类鉴定，其中，该内生真菌的18S rDNA序列分析的分子系统进化树如图3所示，由此可以表明该内生真菌与蟋蟀草平脐蠕孢菌的同源性较高，结合其菌丝形态特征和孢子特征，将其确定为蟋蟀草平脐蠕孢菌(Bipolaris eleusines)。

试验例2

重复实施实施例1-3，得到足够多的蟋蟀草平脐蠕孢菌素I和蟋蟀草平脐蠕孢菌素J。

对所得的蟋蟀草平脐蠕孢菌素I以及蟋蟀草平脐蠕孢菌素J进行结构测定，包括核磁共振测定、高分辨质谱(HRESIMS)测定、紫外测定以及红外测定。

核磁共振测试结果如表1所示：

表1 蟋蟀草平脐蠕孢菌素I和蟋蟀草平脐蠕孢菌素J的¹H和¹³C>

^a数据来源于500MHz>1H NMR图谱以及150MHz>13C>3)。

高分辨质谱测定结果为：蟋蟀草平脐蠕孢菌素I的分子量为m/z575.2250[M+Na]⁺(计算值：C₃₁H₃₆O₉Na，585.2252)；蟋蟀草平脐蠕孢菌素J的分子量为m/z>-(计算值：C₃₁H₃₅O₁₀，567.2236)。

紫外测定结果为：蟋蟀草平脐蠕孢菌素I的主要紫外数据包括(MeOH)：λ_max(logε)203.0(3.65),250.5(3.66),329(2.88)nm；蟋蟀草平脐蠕孢菌素J的分主要紫外数据包括(MeOH)：λ_max(logε)203.0(3.53),246(3.52),329.5(2.58),382.5(2.37)nm。

红外测定结果为：蟋蟀草平脐蠕孢菌素I的主要红外数据包括(KBr)ν_max：3440，2924，1745，1661，1635，1619，1462，1383，1208cm^-1；蟋蟀草平脐蠕孢菌素J的主要红外数据包括(KBr)ν_max：3441，2923，1740，1632，1462，1384，1206，1061cm^-1。

此外，上述蟋蟀草平脐蠕孢菌素I为淡黄色油状物，易溶于氯仿、丙酮和甲醇等有机溶剂，比旋光度为[α]^21.7_D＝+81.3(c>21.5_D＝+22.0(c>

通过上述测定，得出本方案中所得的蟋蟀草平脐蠕孢菌素I和蟋蟀草平脐蠕孢菌素J的化学结构式分别为

试验例3

采用如下试验方法，对实施例中所得的蟋蟀草平脐蠕孢菌素I以及蟋蟀草平脐蠕孢菌素J进行抑菌试验。

试验方法：利用微量肉汤稀释法测定其对以下植物病原菌的抑制作用，即最小抑菌浓度(MIC)。菌种包括：致病疫霉(Phytophthora infestane)，马铃薯早疫病菌链格孢(Alternaria solani)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)。

以96孔板测定蟋蟀草平脐蠕孢菌素I以及蟋蟀草平脐蠕孢菌素J对上述四种植物病原菌的最小抑制浓度。设计浓度为256μg/L，步骤如下：

取96孔板，分别向七个孔中加入5uL营养肉汤(PDA)，往第一个孔中加入5uL 256μg/mL的待测化合物蟋蟀草平脐蠕孢菌素I或蟋蟀草平脐蠕孢菌素J，混匀后，吸5μL加入第二孔中，混匀后，在第二孔中吸5μL加入第三孔，以此类推，直到第七孔，在第七孔中吸取5μL弃掉。再往七个孔中分别加入5μL的菌液混匀，放入保温箱20h，拿出观察直到某个孔还澄清，该孔药物浓度就是最小抑菌浓度MIC，试验结果如表2所示，表2中Hygromycin B代表潮霉素B，其作为阳性对照。

表2蟋蟀草平脐蠕孢菌素I和蟋蟀草平脐蠕孢菌素J对植物病原菌的抑制作用(MIC，μg/mL)

由表2可以看出，蟋蟀草平脐蠕孢菌素I和蟋蟀草平脐蠕孢菌素J对马铃薯早疫病菌链格孢(Alternaria solani)的MIC分别为8μg/mL和16μg/mL，并且蟋蟀草平脐蠕孢菌素I对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的MIC为64μg/mL，说明蟋蟀草平脐蠕孢菌素I能用于抑制马铃薯早疫病菌链格孢和/或尖孢镰刀菌，蟋蟀草平脐蠕孢菌素J能用于抑制马铃薯早疫病菌链格孢。

综上所述，本申请提供的蟋蟀草平脐蠕孢菌素I和蟋蟀草平脐蠕孢菌素J的原料均为天然产物，绿色安全，蟋蟀草平脐蠕孢菌素I能用于抑制马铃薯早疫病菌链格孢和/或尖孢镰刀菌，蟋蟀草平脐蠕孢菌素J能用于抑制马铃薯早疫病菌链格孢。此外，本申请提供的蟋蟀草平脐蠕孢菌素I和蟋蟀草平脐蠕孢菌素J的制备方法简单、易操作，能够有效地从蟋蟀草平脐蠕孢菌发酵液中制备纯度较高且得率较高的蟋蟀草平脐蠕孢菌素I和蟋蟀草平脐蠕孢菌素J。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。