磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器及其制备与应用

摘要

本发明属于电化学生物传感器技术领域，公开了磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器及其制备与应用。所述生物传感器由参比电极、对电极及修饰后的工作电极组成，所述修饰后的工作电极由工作电极及固化在工作电极表面的物质识别膜组成，其中，所述物质识别膜主要由磺化碳纳米管分散液、辣根过氧化物酶溶液及全氟磺酸树脂溶液混合，负载在工作电极表面成膜制备而成。本发明还公开了传感器的制备方法。本发明的制备方法简单且成本低；获得的传感器具有良好的选择性、灵敏度和稳定性，酶的固定量和稳定性好，具有较好的电催化性能；对过氧化氢进行准确检测，抗干扰能力强；同时具有较宽的检测范围，较低的检测限。

说明书

技术领域

本发明属于电化学生物传感器技术领域，具体涉及一种基于磺化碳纳米管的检测过氧化氢的酶生物传感器及其制备方法与应用。

背景技术

过氧化氢是生物体中许多生物化学反应的中间体或产物。广泛应用于食品工业，主要用于消毒、杀菌、消毒、面包发酵等，并且还可用作食品添加剂中的加工助剂。国标中规定，加工助剂一般应在食品中除去而不应成为最终食品的成分，或仅有残留。在加工食品过程中，过氧化氢残留量的检测应严格把控。目前，检测过氧化氢的方法有：传统的检测过氧化氢的方法：滴定法、化学发光法、色谱等。滴定法检测过氧化氢应用广泛，但试剂中常含少量杂质，溶液不稳定；化学发光法检测过氧化氢很容易出现PBS缓冲溶液空白值很高的现象，实验结果很难得到；高效液相色谱法易操作，准确度高，但其选择性较低，相对比而言，电化学传感器具有对目标物有较高的识别能力，样品用量少、响应快，成本低、体积小，便于普及的优点，因此，研发简便、快速、精准、灵敏度高的电化学过氧化氢酶生物传感器将在临床医学上有重大应用前景。

在电化学酶生物传感器的制备过程中，一个非常重要的问题就是酶修饰电极的稳定性和寿命，酶催化剂的固定对传感器的稳定性和寿命有重要的影响。虽然纳米材料会在一定程度上改善酶电极的性能，但是其改善的程度有限。如：碳纳米管是具有一类特殊结构的纳米材料，具有粒径小，比表面积大，表面活性高，催化效率高等优点，由于其特殊的物理化学性质，它在电化学领域被广泛用于酶修饰电极的修饰材料。但是，碳纳米管亲水性不好，在水溶液中分散性不好，限制了其应用。

对于电化学酶生物传感器，还存在另一个要解决的重要问题，酶作为催化剂，其活性中心的外面包裹着一层蛋白质外壳，这层蛋白质外壳阻碍了酶活性中心催化反应产生的电子向电极表面的传递，从而影响了催化电流在检测仪器上的反映，因此，酶修饰电极制备过程中要解决电子从酶活性中心向电极表面的传递问题。在传统电化学过氧化氢酶生物传感器中，采用电子介体可以加速电子从酶活性中心到电极表面转移。但电子媒介体的存在不利于过氧化氢传感器的构建，也不利于待测体系的无污染检测。因此，不需要电子介体的酶生物传感器的制备就具有很大的研究价值。

发明内容

为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种具有良好的选择性、灵敏度和稳定性的磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器。

本发明的另一目的在于提供上述磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述基于磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器在过氧化氢检测中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器，由参比电极、对电极及修饰后的工作电极组成，所述修饰后的工作电极由工作电极及固化在工作电极表面的物质识别膜组成，其中，所述物质识别膜主要由磺化碳纳米管分散液(SCNT)、辣根过氧化物酶溶液(HRP)及全氟磺酸树脂溶液(Nafion)混合，负载在工作电极表面成膜制备而成；

所述全氟磺酸树脂溶液为通过调节pH为中性的全氟磺酸树脂溶液；所述磺化碳纳米管分散液(SCNT)是将磺化碳纳米管分散于全氟磺酸树脂溶液(酸性溶液)中得到；所述辣根过氧化物酶溶液(HRP)是采用PBS溶液将辣根过氧化物酶配成溶液得到。

所述磺化碳纳米管：辣根过氧化物酶的质量比为(2.5～15)：(5～50)。

所述磺化碳纳米管是将碳纳米管进行酸化，获得酸化碳纳米管；然后采用对氨基苯磺酸重氮盐进行磺化处理得到。所述对氨基苯磺酸重氮盐与酸化碳纳米管的摩尔质量比为(0.5～2.9)mmol：100mg；所述磺化处理的条件为冰浴条件下搅拌反应1～5h。

上述磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)对基底电极进行表面预处理；

(2)将磺化碳纳米管分散于全氟磺酸树脂溶液(酸性溶液)中，得到磺化碳纳米管分散液；采用PBS溶液将辣根过氧化物酶配成溶液，得到辣根过氧化物酶溶液(HRP)；调节全氟磺酸树脂溶液的pH至中性，获得中性全氟磺酸树脂溶液；

(3)将磺化碳纳米管材料分散液、辣根过氧化物酶溶液及中性全氟磺酸树脂溶液混合均匀得复合溶液；

(4)将复合溶液滴加到步骤(1)的电极表面，室温晾干，得到基于磺化碳纳米管的酶修饰工作电极；

(5)将修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到检测过氧化氢的生物传感器。

所述磺化碳纳米管的具体制备步骤：

(a)将碳纳米管进行酸化处理，获得酸化碳纳米管；

(b)然后采用对氨基苯磺酸重氮盐对酸化处理的碳纳米管进行磺化处理，获得磺化碳纳米管。

步骤(a)中所述酸化处理是指采用浓硝酸与浓硫酸的混合酸进行处理。

步骤(b)中所述磺化处理：(b-1)将酸化碳纳米管分散于水中，获得酸化碳纳米管分散液；(b-2)将对氨基苯磺酸重氮盐与酸化碳纳米管分散液混合，冰浴1-5小时，再在室温下冷却1-3小时，然后超声15-20分钟，洗涤，干燥，获得磺化碳纳米管。

步骤a)中对氨基苯磺酸重氮盐是通过以下方法得到：184mg对氨基苯磺酸、72mg亚硝酸钠、30-100mL水和1-6g 1mol/L盐酸或硫酸在冰浴条件下进行反应，获得含有对氨基苯磺酸重氮盐的溶液。

步骤(1)中所述表面预处理具体是指：将基底电极的表面依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光成镜面，再用水冲洗；然后依次在无水乙醇和水中超声清洗，取出用水洗净，晾干。

步骤(2)中所述磺化碳纳米管材料分散液的浓度为2.5～15mg/mL，分散剂为全氟磺酸树脂溶液(Nafion溶液，酸性溶液)，其质量浓度0.5-1％。所述全氟磺酸树脂溶液为5％杜邦Nafion溶液用乙醇稀释至0.5-1.0％制得。

步骤(2)中所述辣根过氧化物酶溶液的浓度为5～50mg/mL，酶溶液是采用PBS溶液配制的(pH 7.0，0.1M)。

步骤(2)中所述中性全氟磺酸树脂溶液为由强碱溶液调节全氟磺酸树脂溶液的pH为中性制得；所述全氟磺酸树脂溶液为5％杜邦Nafion溶液用乙醇稀释至0.5-1.0％制得；所述强碱为0.1mol/L氢氧化钠。

步骤(3)中所述磺化碳纳米管分散液、辣根过氧化物酶溶液及中性全氟磺酸树脂溶液的体积比为1:1:1。

步骤(4)中所述复合溶液滴加量为3～10μL。

上述磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器在过氧化氢定量检测中的应用。

本发明将碳纳米管经过酸处理增加了酶的吸附性和稳定性；而将酸化的碳纳米管进行磺化处理，把磺酸基团引入碳纳米管中有利于增加其结构的有序性和导电性，提高其亲水性，有效的提高酶催化剂的载量，从而提高酶修饰电极的性能，也可以增加酶修饰电极的稳定性，使过氧化氢酶生物传感器表现出更优异的性能。

本发明的原理：

本发明首先是制备磺化碳纳米管材料，该材料先通过酸处理引入羧基来增加酶的吸附性和稳定性，随后进行磺化处理引入磺酸基团，进而增加其结构的有序性和导电性。然后，利用全氟磺酸树脂的成膜性，有力增加酶催化剂在电极表面的固定量和稳定性，以利于对底物的催化；最后，取适量混合液滴于已表面预处理的工作电极上，得到修饰后的工作电极；再利用修饰后的工作电极，配合参比电极与对电极组成三电极体系，制得一种检测过氧化氢的酶生物传感器。

本发明将磺化碳纳米管、辣根过氧化物酶应用于酶生物传感器，制备的检测过氧化氢的电化学酶生物传感器性能良好，检测范围为4×10^-5～3×10^-4mol/L，线性方程为I(μA)＝-1.3817-0.825C(mg/L)，相关系数为R²＝0.9924，检测限为4.7×10^-5mol/L。

本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：

(1)本发明所述的检测过氧化氢的生物传感器具有良好的电子传递性，能将反应产生的电子进行良好的转移，能实现生物分子的选择性检测，提高所述生物传感器的反应速度。

(2)本发明所述的检测过氧化氢的生物传感器具有良好的选择性、重现性和稳定性，可对过氧化氢进行准确检测，抗干扰能力强。

(3)本发明所述的检测过氧化氢的生物传感器可用于食品中过氧化氢的检测，制备简单，具有较宽的检测范围，较低的检测限，反应在室温中性环境下进行，性能稳定，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为磺化碳纳米管修饰电极(SCNT+Nafion)、辣根过氧化物酶(HRP)修饰电极(HRP+Nafion)、磺化碳纳米管和辣根过氧化物酶复合修饰电极(SCNT+HRP)以及实施例2制备的电极(磺化碳纳米管-辣根过氧化物酶-Nafion复合修饰电极，SCNT+HRP+Nafion)在磷酸缓冲溶液中的循环伏安图；

图2为实施例2中制备的磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器在磷酸缓冲溶液中滴加不同浓度的过氧化氢后产生的响应电流标准曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。各实施例中酸化碳纳米管：将1g碳纳米管置于40ml浓硝酸与浓硫酸的混合酸中(1：3v/v)，50℃下超声6h获得。

实施例1

一种基于磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的玻碳电极；

(2)将100mg酸化后的碳纳米管(酸化碳纳米管)置于100mL蒸馏水中超声分散30分钟，得到1mg/mL酸化的碳纳米管悬浮液；将72mg亚硝酸钠溶于40mL蒸馏水中，冷却至0-5℃，获得亚硝酸钠水溶液；随后将184mg对氨基苯磺酸和2g盐酸溶液(1mol/L)加入亚硝酸钠水溶液中均匀混合，冰浴30分钟，得到芳基重氮盐(对氨基苯磺酸重氮盐)；将上述芳基重氮盐在不断搅拌下缓慢滴加入酸化碳纳米管悬浮液中，酸化碳纳米管与对氨基苯磺酸的质量比1：1.84，冰浴2小时，再室温下冷却2小时，然后超声15-20分钟，最后抽滤洗涤4-5次，冷冻干燥后制得磺化碳纳米管；

(3)将磺化碳纳米管用0.8％的全氟磺酸树脂溶液分散为浓度为2.5mg/mL的分散液，采用PBS溶液(0.1mol/L、pH 7.0)配制浓度为25mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，采用0.1mol/L NaOH溶液调节0.8％全氟磺酸树脂溶液至pH 7.0；将三种溶液以1:1:1体积比混合得到混合溶液，取5μL混合溶液滴于步骤(1)的电极表面，在室温下晾干，得到基于磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的修饰工作电极；

(4)将修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极)，得到检测过氧化氢的生物传感器。

在室温下进行电化学试验，均在10mL磷酸缓冲溶液(0.1mol/L、pH 7.0)中进行，测试之前通N₂，测试过程中采用循环伏安法。其中空白对照未滴加过氧化氢溶液(PBS溶液)，测试稳定后依次滴加400μL过氧化氢溶液。

本实施例在过氧化氢浓度为0.1mmol/L时，测试的还原峰催化电流为1.43μA。

实施例2

一种基于磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的玻碳电极；

(2)将100mg酸化后的碳纳米管置于100mL蒸馏水中超声分散30分钟，得到1mg/mL酸化的碳纳米管悬浮液；将72mg亚硝酸钠溶于40mL蒸馏水中，冷却至0-5℃，随后将184mg对氨基苯磺酸和2g盐酸水溶液(1mol/L)加入亚硝酸钠水溶液中均匀混合，冰浴30分钟，得到芳基重氮盐；将芳基重氮盐在不断搅拌下缓慢滴加入酸化的碳纳米管悬浮液中，酸化碳纳米管与对氨基苯磺酸的质量比1：1.84，冰浴2小时，再室温下冷却2小时，然后超声15-20分钟，最后抽滤洗涤4-5次，冷冻干燥后制得磺化碳纳米管材料；

(3)将磺化碳纳米管材料用0.8％的全氟磺酸树脂溶液分散为浓度为5mg/mL的溶液，采用PBS溶液(0.1mol/L、pH 7.0)配制浓度为25mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，采用0.1mol/L NaOH溶液调节0.8％全氟磺酸树脂溶液(Nafion)至pH 7.0，获得中性全氟磺酸树脂溶液；将三种溶液以1:1:1体积比混合得到混合溶液，取5μL混合物滴于步骤(1)的电极表面，在室温下晾干，得到基于磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的酶修饰工作电极；

(4)将修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极)，得到检测过氧化氢的生物传感器。

在室温下进行电化学试验，均在10mL磷酸缓冲溶液(0.1mol/L、pH 7.0)中进行，测试之前通N₂，测试过程中采用循环伏安法。其中空白对照未滴加过氧化氢溶液，测试稳定后依次滴加400μL过氧化氢溶液。

本实施例在过氧化氢浓度为0.1mmol/L时，测试的还原峰催化电流为1.5525μA。

将磺化碳纳米管(SCNT)修饰电极(除了无辣根过氧化物酶(HRP)，其制备条件与实施例2相同)、辣根过氧化物酶(HRP)修饰电极(除了磺化碳纳米管，其制备条件与实施例2相同)、磺化碳纳米管和辣根过氧化物酶复合修饰电极(无Nafion，其制备条件与实施例2相同)，与本实施例制备的磺化碳纳米管-辣根过氧化物酶-Nafion复合修饰电极的循环伏安性能进行了对比。测试结果如图1所示。图1为磺化碳纳米管修饰电极(SCNT+Nafion)、辣根过氧化物酶(HRP)修饰电极(HRP+Nafion)、磺化碳纳米管和辣根过氧化物酶复合修饰电极(SCNT+HRP)以及实施例2制备的电极(磺化碳纳米管-辣根过氧化物酶-Nafion复合修饰电极，SCNT+HRP+Nafion)在磷酸缓冲溶液中的循环伏安图。

从图1可知，当电极单独负载磺化碳纳米管材料时，没有氧化还原峰出现，表明没有催化电流产生，但电容电流最大；而负载了磺化碳纳米管材料的电极，其催化电流明显大于仅负载辣根过氧化酶的电极，这一现象表明，磺化碳纳米管材料可以促进酶修饰电极的电化学催化能力。图中还对比了没有滴加Nafion溶液的磺化碳纳米管-辣根过氧化物酶复合电极的性能，可以看出其催化电流明显比滴加了Nafion溶液的磺化碳纳米管-辣根过氧化物酶电极低，再次证明了Nafion粘合剂在修饰酶生物电极中起重要作用：Nafion可在电极表面形成一层溶液固膜，防止辣根过氧化酶溶于水溶液中，并保护电极不受损坏。

本实施例制备的基于磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器在磷酸缓冲溶液中滴加不同浓度的过氧化氢后产生的响应电流标准曲线图如图2所示。该修饰电极对底物检测范围为4×10^-5～3×10^-4mol/L，线性方程为I(μA)＝-1.3817-0.825C(mg/L)(即y＝1.3817+0.825C，I(μA)＝-y)，相关系数为R²＝0.9924，检测限为4.7×10^-5mol/L。

实施例3

一种基于磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的玻碳电极；

(2)将100mg酸化后的碳纳米管置于100mL蒸馏水中超声分散30分钟，得到1mg/mL酸化的碳纳米管悬浮液；将72mg亚硝酸钠溶于40mL蒸馏水中，冷却至0-5℃，随后将184mg对氨基苯磺酸和2g盐酸水溶液(1mol/L)加入亚硝酸钠水溶液中均匀混合，冰浴30分钟，得到芳基重氮盐；将上述步骤制好的芳基重氮盐在不断搅拌下缓慢滴加入从上述步骤得到的酸化碳纳米管悬浮液中。冰浴2小时，再室温下冷却2小时，然后超声15-20分钟，最后抽滤洗涤4-5次，冷冻干燥后制得磺化碳纳米管材料；

(3)将磺化碳纳米管材料用0.8％的全氟磺酸树脂溶液分散为浓度为7.5mg/mL的溶液，采用PBS溶液(0.1mol/L、pH 7.0)配制浓度为25mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，采用0.1mol/L NaOH溶液调节0.8％全氟磺酸树脂溶液至pH 7.0；将三种溶液以1:1:1体积比混合得到混合溶液，取5μL混合物滴于步骤(1)的电极表面，在室温下晾干，得到基于磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的酶修饰工作电极；

(4)将修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极)，得到检测过氧化氢的生物传感器。

在室温下进行电化学试验，均在10mL磷酸缓冲溶液(0.1mol/L、pH 7.0)中进行，测试之前通N₂，测试过程中采用循环伏安法。其中空白对照未滴加过氧化氢溶液，测试稳定后依次滴加400μL过氧化氢溶液。

本实施例在过氧化氢浓度为0.1mmol/L时，测试的还原峰催化电流为1.499μA。

实施例4

一种基于磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的玻碳电极；

(2)将100mg酸化后的碳纳米管置于100mL蒸馏水中超声分散30分钟，得到1mg/mL酸化的碳纳米管悬浮液；将72mg亚硝酸钠溶于40mL蒸馏水中，冷却至0-5℃，随后将184mg对氨基苯磺酸和2g盐酸水溶液(1mol/L)加入亚硝酸钠水溶液中均匀混合，冰浴30分钟，得到芳基重氮盐；将上述步骤制好的芳基重氮盐在不断搅拌下缓慢滴加入从上述步骤得到的酸化碳纳米管悬浮液中，冰浴2小时，再室温下冷却2小时，然后超声15-20分钟，最后抽滤洗涤4-5次，冷冻干燥后制得磺化碳纳米管材料；

(3)将磺化碳纳米管材料用0.8％的全氟磺酸树脂溶液分散为浓度为10mg/mL的溶液，采用PBS溶液(0.1mol/L、pH 7.0)配制浓度为25mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，采用0.1mol/L NaOH溶液调节0.8％全氟磺酸树脂溶液至pH 7.0；将三种溶液以1:1:1体积比混合得到混合溶液，取5μL混合溶液滴于步骤(1)的电极表面，在室温下晾干，得到基于磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的酶修饰工作电极；

(4)将修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极)，得到检测过氧化氢的生物传感器。

在室温下进行电化学试验，均在10mL磷酸缓冲溶液(0.1mol/L、pH 7.0)中进行，测试之前通N₂，测试过程中采用循环伏安法。其中空白对照未滴加过氧化氢溶液，测试稳定后依次滴加400μL过氧化氢溶液。

本实施例在过氧化氢浓度为0.1mmol/L时，测试的还原峰催化电流为1.497μA。

实施例5

一种基于磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的玻碳电极；

(2)将100mg酸化后的碳纳米管置于100mL蒸馏水中超声分散30分钟，得到1mg/mL酸化的碳纳米管悬浮液；将72mg亚硝酸钠溶于40mL蒸馏水中，冷却至0-5℃，随后将184mg对氨基苯磺酸和2g盐酸水溶液(1mol/L)加入亚硝酸钠水溶液中均匀混合，冰浴30分钟，得到芳基重氮盐；将上述步骤制好的芳基重氮盐在不断搅拌下缓慢滴加入从上述步骤得到的酸化碳纳米管悬浮液中，冰浴2小时，再室温下冷却2小时，然后超声15-20分钟，最后抽滤洗涤4-5次，冷冻干燥后制得磺化碳纳米管材料；

(3)将磺化碳纳米管复合材料用0.8％的全氟磺酸树脂溶液分散为浓度为12.5mg/mL的溶液，采用PBS溶液(0.1mol/L、pH 7.0)配制浓度为25mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，采用0.1mol/L NaOH溶液调节0.8％全氟磺酸树脂溶液至pH 7.0；将三种溶液以1:1:1体积比混合得到混合溶液，取5μL混合溶液滴于步骤(1)的电极表面，在室温下晾干，得到基于磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的酶修饰工作电极；

(4)将修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极)，得到检测过氧化氢的生物传感器。

在室温下进行电化学试验，均在10mL磷酸缓冲溶液(0.1mol/L、pH 7.0)中进行，测试之前通N₂，测试过程中采用循环伏安法。其中空白对照未滴加过氧化氢溶液，测试稳定后依次滴加400μL过氧化氢溶液。

本实施例在过氧化氢浓度为0.1mmol/L时，测试的还原峰催化电流为1.4725μA。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。