一种细菌I型拓扑异构酶抑制剂、抗菌药物和制备方法

摘要

本发明公开了一种细菌I型拓扑异构酶抑制剂、抗菌药物和制备方法，涉及抗菌药物领域。本发明公开的细菌I型拓扑异构酶抑制剂为具有错配碱基的环状闭合双链核苷酸。该抑制剂可以靶向细菌I型拓扑异构酶，起到抑制细菌I型拓扑异构酶的作用，其该抑制剂具有高稳定性，在体内不易被降解，对细菌I型拓扑异构酶具有高度靶向性的特点，可以用于制备抗菌药物。

说明书

技术领域

本发明涉及抗菌药物领域，具体而言，涉及一种细菌I型拓扑异构酶抑制剂、抗菌药物和制备方法。

背景技术

由于抗生素的滥用，细菌的耐药性成为了最为严重的问题之一。所以开发新型药已经是一个迫在眉睫的问题。抗菌药的原则应该是提高对病原物的选择性，同时对机体的毒性也要达到最低，其在机体内以较稳定方式存在。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细菌I型拓扑异构酶抑制剂，该抑制剂可以靶向细菌I型拓扑异构酶，起到抑制细菌I型拓扑异构酶的作用，其该抑制剂具有高稳定性，在体内不易被降解，对细菌I型拓扑异构酶具有高度靶向性的特点，可以用于制备抗菌药物。

本发明的另一目的在于提供具有错配碱基的环状闭合双链核苷酸的应用。

本发明的另一目的在于提供一种抗菌药物，其含有上述的细菌I型拓扑异构酶抑制剂，具有杀菌或抑菌作用。

本发明的另一目的在于提供一种制备上述抑制剂的方法。

本发明是这样实现的：

细菌I型拓扑异构酶(TopIA)是原核细菌的一种关键酶，它具有舒缓细菌DNA负超螺旋，改变细菌拓扑结构，对细菌的正常复制、转录以及生长等方面有着十分重要的作用。

一方面，本发明提供了一种细菌I型拓扑异构酶抑制剂，其为具有错配碱基的环状闭合双链核苷酸。

本发明利用细菌I型拓扑异构酶(识别双链DNA中任意一段打开的单链DNA从而发挥其作用的特性)，设计出一种新的具有错配碱基的细菌I型拓扑异构酶抑制剂即有错配碱基的环状闭合双链核苷酸。细菌I型拓扑异构酶与该抑制剂形成不可逆的共价结合，从而起到抑制细菌I型拓扑异构酶的作用，相较于现有的同类细菌I型拓扑异构酶抑制剂例如非闭合环状的具有错配碱基的线型双链核苷酸具有更低的IC50；且本发明提供的细菌I型拓扑异构酶抑制剂为环状闭合双链结构，其不易降解，具有较高的稳定性，对细菌I型拓扑异构酶具有高度靶向性，对机体的毒性较低。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述环状闭合双链核苷酸的长度为80-90bp；优选为86bp。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述环状闭合双链核苷酸的错配碱基的个数为1-7个。优选为1个、3个、5个或7个。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，当错配碱基的个数大于1个时，多个错配碱基是连续的。

多个错配碱基是连续意指多个错配碱基之间没有间隔有正确配对的碱基。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，每个错配碱基的类型是如下(a)-(d)种的任意一种：

(a)碱基A与选自G、C和A中的任意一种碱基错配，优选与碱基G错配；

(b)碱基T与选自G、C和A中的任意一种碱基错配，优选与碱基C或碱基G错配；

(c)碱基G与碱基G错配；

(d)碱基C与碱基C错配。

优选的，所述错配碱基选自A与G错配、AAT与GGC错配、GCAAT与GCGGC错配和GTGCAAT与GGGCGGC错配中的任意一种。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述环状闭合双链核苷酸的错配碱基的个数为1个，错配碱基的类型为A与G错配；

优选的，所述环状闭合双链核苷酸的长度为86bp；

进一步优选的，所述环状闭合双链核苷酸中，一条单链环状核苷酸由SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列首尾相连形成，另一条单链环状核苷酸由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列首尾相连形成。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述环状闭合双链核苷酸的错配碱基的个数为3个，错配碱基的类型为AAT与GGC错配；

优选的，所述环状闭合双链核苷酸的长度为86bp；

进一步优选的，所述环状闭合双链核苷酸中，一条单链环状核苷酸由SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列首尾相连形成，另一条单链环状核苷酸由SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列首尾相连形成。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述环状闭合双链核苷酸的错配碱基的个数为5个，错配碱基的类型为GCAAT与GCGGC错配；

优选的，所述环状闭合双链核苷酸的长度为86bp；

进一步优选的，所述环状闭合双链核苷酸中，一条单链环状核苷酸由SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列首尾相连形成，另一条单链环状核苷酸由SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列首尾相连形成。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述环状闭合双链核苷酸的错配碱基的个数为7个，错配碱基的类型为GTGCAAT与GGGCGGC错配；

优选的，所述环状闭合双链核苷酸的长度为86bp；

进一步优选的，所述环状闭合双链核苷酸中，一条单链环状核苷酸由SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列首尾相连形成，另一条单链环状核苷酸由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列首尾相连形成。

另一方面，本发明提供了具有错配碱基的环状闭合双链核苷酸在制备细菌I型拓扑异构酶抑制剂中的应用。

本发明的研究首次发现，具有错配碱基的环状闭合双链核苷酸可与细菌I型拓扑异构酶结合，起到抑制细菌I型拓扑异构酶的作用。因此，具有错配碱基的环状闭合双链核苷酸可以用于制备细菌I型拓扑异构酶抑制剂，也可以用于制备抗菌药物，通过对细菌I型拓扑异构酶的抑制，起到杀菌或抑菌效果。

相较于现有的同类细菌I型拓扑异构酶抑制剂例如非闭合环状的具有错配碱基的线型双链核苷酸，采用环状闭合双链核苷酸用于抑制细菌I型拓扑异构酶，其具有更低的IC50；且其为环状闭合双链结构，不易降解，具有较高的稳定性，对TopIA具有高度靶向性，对机体的毒性较低。

再一方面，本发明提供了一种抗菌药物，其含有上述细菌I型拓扑异构酶抑制剂。

该抗菌药物利用上述细菌I型拓扑异构酶抑制剂对细胞细菌I型拓扑异构酶不可逆的共价结合特性，起到抑制菌I型拓扑异构酶的作用，进而发挥抗菌效果。

再一方面，本发明提供了一种制备上述细菌I型拓扑异构酶抑制剂的方法，其包括：将具有错配碱基的两条互补单链核苷酸混合经变性、退火处理后，用DNA连接酶连接形成环状闭合双链核苷酸。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，变性的条件为：温度94-96℃，时间1-3min。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，退火按如下操作进行：将经变性后的两条互补单链核苷酸置于冰上冷却4-6min。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，将含有两条互补单链核苷酸的混合溶液置于94-96℃条件下放置1-3min，然后置于冰上快速冷却4-6min，其中，混合溶液含有Na⁺。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，混合溶液中Na⁺的浓度为40-60mM，每条单链核苷酸的浓度为2-3μM。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，两条互补单链核苷酸各自具有的错配碱基的个数为1-7个。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，当错配碱基的个数大于1个时，多个错配碱基是连续的。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，每个错配碱基的类型可以是如下(a)-(d)种的任意一种：

(a)碱基A与选自G、C和A中的任意一种碱基错配；

(b)碱基T与选自G、C和A中的任意一种碱基错配；

(c)碱基G与碱基G错配；

(d)碱基C与碱基C错配。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，两条互补单链核苷酸各自的长度为80-90bp。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，两条互补单链核苷酸各自的碱基序列如下(1)-(4)中任一项所示：

(1)两条互补单链核苷酸中的一条单链核苷酸5’端往3’端方向的碱基序列如SEQID NO.1所示，另一条单链核苷酸5’端往3’端方向的碱基序列如SEQ IDNO.2所示；

(2)两条互补单链核苷酸中的一条单链核苷酸5’端往3’端方向的碱基序列如SEQID NO.1所示，另一条单链核苷酸5’端往3’端方向的碱基序列如SEQ IDNO.3所示；

(3)两条互补单链核苷酸中的一条单链核苷酸5’端往3’端方向的碱基序列如SEQID NO.1所示，另一条单链核苷酸5’端往3’端方向的碱基序列如SEQ IDNO.4所示；

(4)两条互补单链核苷酸中的一条单链核苷酸5’端往3’端方向的碱基序列如SEQID NO.1所示，另一条单链核苷酸5’端往3’端方向的碱基序列如SEQ IDNO.5所示。

采用本发明提供的制备方法，可以将具有错配碱基的两条互补单链核苷酸形成环状闭合双链核苷酸，且制得的环状闭合双链核苷酸可以与细菌I型拓扑异构酶结合，起到抑制作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中的带有缺口的环状双链核苷酸的结构示意图。

图2为实施例1提供的具有1个错配碱基的环状闭合双链核苷酸的结构示意图。

图3为实施例2提供的具有3个错配碱基的环状闭合双链核苷酸的结构示意图。

图4为实施例3提供的具有5个错配碱基的环状闭合双链核苷酸的结构示意图。

图5为实施例4提供的具有7个错配碱基的环状闭合双链核苷酸的结构示意图。

图6为实验例1中的检测实施例1提供的1个错配碱基的环状闭合双链核苷酸对TopIA的抑制效果的结果。

图7为实验例2中的检测实施例2提供的3个错配碱基的环状闭合双链核苷酸对TopIA的抑制效果的结果。

图8为实验例3中的检测实施例3提供的5个错配碱基的环状闭合双链核苷酸对TopIA的抑制效果的结果。

图9实验例4中的检测实施例4提供的7个错配碱基的环状闭合双链核苷酸对TopIA的抑制效果的结果。

图10为实验例5中的对实施例1-4提供的环状闭合双链核苷酸的环状结构检测的电泳结果，图中：1-5分别代表SEQ ID NO.1-5所示的单链核苷酸；6-9代表实施例1-4得到的环状闭合双链核苷酸产物。

图11为实验例5中的对实施例1-4提供的环状闭合双链核苷酸的环状闭合结构检测的电泳结果，图中：Lane 1代表实施例1中的经T4连接后的产物；Lane 2代表实施例1中的经EXOI酶切后的产物；Lane 3代表实施例1中的经EXOIII酶切后的产物；Lane4代表实施例2中的经T4连接后的产物；Lane5代表实施例2中的经EXOI酶切后的产物；Lane 6代表实施例2中的经EXOIII酶切后的产物；Lane 7代表实施例3中的经T4连接后的产物；Lane 8代表实施例3中的经EXOI酶切后的产物；Lane 9代表实施例3中的经EXOIII酶切后的产物；Lane 10代表实施例4中的经T4连接后的产物；Lane 11代表实施例4中的经EXOI酶切后的产物；Lane12代表实施例4中的经EXOIII酶切后的产物。

图12为实验例1中的1-mis的IC50曲线图。

图13为实验例2中的3-mis的IC50曲线图。

图14为实验例3中的5-mis的IC50曲线图。

图15为实验例4中的7-mis的IC50曲线图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的细菌I型拓扑异构酶抑制剂，其为具有1个错配碱基的环状闭合双链核苷酸，其长度为86bp，其错配碱基的类型为A/G(即A与G错配)。

该环状闭合双链核苷酸中，一条单链环状核苷酸由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列首尾相连形成，另一条单链环状核苷酸由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列首尾相连形成。

该环状闭合双链核苷酸的结构如图2所示，图中箭头所指处为错配碱基。

本实施例提供的细菌I型拓扑异构酶抑制剂的制备方法如下：

(1)提供如下两条具有错配碱基的单链核苷酸(由南京一道公司协助合成，该公司提供的单链DNA均为2OD)，其5’端具有磷酸化修饰：

单链核苷酸1(SEQ ID NO.1)：

5'ATCTTCATCGAACAAGACCCGTGCAATGCTATCGACATCAAGGCCTATCGCTTGGGAGTCAATGGGTTCAGGATGCAGGTGAGGAT3'；

单链核苷酸2(SEQ ID NO.2)：

5'CCTTGATGTCGATAGCAGTGCACGGGTCTTGTTCGATGAAGATATCCTCACCTGCATCCTGAACCCATTGACTCCCAAGCGATAGG3'；

下划线为错配碱基位置。

(2)将各单链核苷酸稀释至浓度为100μM的12.5μL溶液，再各取单链核苷酸溶液，稀释6倍；再各取稀释6倍后的单链核苷酸溶液5μL，与10μL 100mM的Nacl溶液混合，得到混合的单链DNA溶液，总体积为20μL，Na离子终浓度为50mM。

(3)将混合的单链DNA溶液至于金属浴上95℃放置2min，取出后放置冰上快速冷却5min。此时，两条具有错配碱基的单链核苷酸形成带有2个缺口的环状双链互补核苷酸(其结构如图1所示)。

(4)然后在混合的单链DNA溶液中加入去离子水6μL、10×DNA连接酶buffer 3μL以及1μL(350U)的T4DNA连接酶，混匀，16℃过夜，取部分产物电泳，结果见图11。带有2个缺口的环状双链互补核苷酸的缺口通过DNA连接酶连接，形成具有1个错配碱基的环状闭合双链核苷酸。

(5)次日，将连接产物放置在65℃金属浴上15min，将连接酶灭活，随后在得到的连接产物中加入1μL去离子水、10×EXO I buffer 4μL以及5μL(25U)的EXO I外切酶，混匀37℃，金属浴放置8小时，随后将酶切完的产物放置在金属浴上80℃15min将酶灭活。取部分产物电泳，结果见图11。

(6)随后加入40μL的去离子水、10×EXO III buffer 9μL以及1μL(200U)EXOIII外切酶，混匀，37℃金属浴放置8小时，随后将酶切产物放置金属浴65℃5min将酶灭活。取部分产物电泳，结果见图11。

(7)将得到的产物放置于真空干燥浓缩机进行浓缩，随后进行非变性page胶的切胶回收，将回收的产物再次浓缩，即为较纯的本实施例的环状闭合双链核苷酸，测浓度，待用。

实施例2

本实施例提供的细菌I型拓扑异构酶抑制剂，其为具有3个错配碱基的环状闭合双链核苷酸，其长度为86bp，其错配碱基的类型为AAT/GGC(即AAT与GGC错配)。

该环状闭合双链核苷酸中，一条单链环状核苷酸由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列首尾相连形成，另一条单链环状核苷酸由SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列首尾相连形成。

该环状闭合双链核苷酸的结构如图3所示，图中箭头所指处为错配碱基。

本实施例提供的细菌I型拓扑异构酶抑制剂的制备方法如下：

(1)提供如下两条具有错配碱基的单链核苷酸(由南京一道公司协助合成，该公司提供的单链DNA均为2OD)，其5’端具有磷酸化修饰：

单链核苷酸3(SEQ ID NO.1)：

5'ATCTTCATCGAACAAGACCCGTGCAATGCTATCGACATCAAGGCCTATCGCTTGGGAGTCAATGGGTTCAGGATGCAGGTGAGGAT3'

单链核苷酸4(SEQ ID NO.3)：

5'CCTTGATGTCGATAGCCGGGCACGGGTCTTGTTCGATGAAGATATCCTCACCTGCATCCTGAACCCATTGACTCCCAAGCGATAGG3'；

下划线为错配碱基位置。

其余步骤参考实施例1。

实施例3

本实施例提供的细菌I型拓扑异构酶抑制剂，其为具有5个错配碱基的环状闭合双链核苷酸，其长度为86bp，其错配碱基的类型为GCAAT/GCGGC(即GCAAT与GCGGC错配)。

该环状闭合双链核苷酸中，一条单链环状核苷酸由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列首尾相连形成，另一条单链环状核苷酸由SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列首尾相连形成。

该环状闭合双链核苷酸的结构如图4所示，图中箭头所指处为错配碱基。

本实施例提供的细菌I型拓扑异构酶抑制剂的制备方法如下：

(1)提供如下两条具有错配碱基的单链核苷酸(由南京一道公司协助合成，该公司提供的单链DNA均为2OD)，其5’端具有磷酸化修饰：

单链核苷酸5(SEQ ID NO.1)：

5'ATCTTCATCGAACAAGACCCGTGCAATGCTATCGACATCAAGGCCTATCGCTTGGGAGTCAATGGGTTCAGGATGCAGGTGAGGAT3'；

单链核苷酸6(SEQ ID NO.4)：

5'CCTTGATGTCGATAGCCGGCGACGGGTCTTGTTCGATGAAGATATCCTCACCTGCATCCTGAACCCATTGACTCCCAAGCGATAGG3'；

下划线为错配碱基位置。

其余步骤参考实施例1。

实施例4

本实施例提供的细菌I型拓扑异构酶抑制剂，其为具有7个错配碱基的环状闭合双链核苷酸，其长度为86bp，其错配碱基的类型为GTGCAAT/GGGCGGC(即GTGCAAT与GGGCGGC)。

该环状闭合双链核苷酸中，一条单链环状核苷酸由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列首尾相连形成，另一条单链环状核苷酸由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列首尾相连形成。

该环状闭合双链核苷酸的结构如图5所示，图中箭头所指处为错配碱基。

本实施例提供的细菌I型拓扑异构酶抑制剂的制备方法如下：

(1)提供如下两条具有错配碱基的单链核苷酸(由南京一道公司协助合成，该公司提供的单链DNA均为2OD)，其5’端具有磷酸化修饰：

单链核苷酸7(SEQ ID NO.1)：

5'ATCTTCATCGAACAAGACCCGTGCAATGCTATCGACATCAAGGCCTATCGCTTGGGAGTCAATGGGTTCAGGATGCAGGTGAGGAT3'；

单链核苷酸8(SEQ ID NO.5)：

5'CCTTGATGTCGATAGCCGGCGGGGGGTCTTGTTCGATGAAGATATCCTCACCTGCATCCTGAACCCATTGACTCCCAAGCGATAGG3'；

下划线为错配碱基位置。

制备方法参考实施例1。

实验例1

检测实施例1的具有1个错配碱基的环状闭合双链核苷酸(标记为1-mis)对TopIA的抑制作用。

(1)取7个1.5ml离心管分别编号1-7，1号管中最终包括50ng质粒PBR322，2-7管最终包含50mM KAc，20mM Tris-Ac，10mM Mg(Ac)2，100μg/mlBSA(pH 7.9@25℃)、50ngPBR322以及0.1U的TopIA，3-7号管再添加不同终浓度依次为260nM、130nM、65nM、32.5nM、16.25nM的1-mis。最后将各个管涡旋振荡仪上震荡数秒随后快速离心，将各管放入PCR仪37℃孵育30min。

(2)凝胶电泳实验：精确称取0.6g琼脂糖加入到锥形瓶中，随后加入60mlTAE缓冲液，均匀加热至澄清透明，随后将其缓慢倒入水平电泳槽内冷却成胶。

(3)在1-7管中加入2μL loading buffer，震荡离心，然后点样，电泳在100W条件下运行45min，待电泳结束后将凝胶取出在DNA染料的溶液中(100mlTAE+10μL染料)浸泡然后放入摇床1h后，用TAE冲洗1-2次，再使用伯乐凝胶成像仪成像拍照，然后使用软件计算出其IC50。结果见图6和图12。

从图6和图12中，可以发现随着1-mis浓度不断增加，其对TopIA的抑制效果也越来越强，1-mis对TopIA的IC50：62nM。

实验例2

检测实施例2的具有3个错配碱基的环状闭合双链核苷酸(标记为3-mis)对TopIA的抑制作用。

(1)取7个1.5ml离心管分别编号1-7，1号管中最终包括50ng质粒PBR322，2-7管最终包含50mM KAc，20mM Tris-Ac，10mM Mg(Ac)2，100μg/mlBSA(pH 7.9@25℃)、50ng PBR322以及0.1U的TopIA，3-7号管再添加不同终浓度依次为230nM、115nM、58nM、29nM、14.5nM的3-mis。最后将各个管涡旋振荡仪上震荡数秒随后快速离心，将各管放入PCR仪37℃孵育30min。

(2)凝胶电泳实验：精确称取0.6g琼脂糖加入到锥形瓶中，随后加入60mlTAE缓冲液，均匀加热至澄清透明，随后将其缓慢倒入水平电泳槽内冷却成胶。

(3)在1-7管中加入2μL loading buffer，震荡离心，然后点样，电泳在100W条件下运行45min，待电泳结束后将凝胶取出在DNA染料的溶液中(100mlTAE+10μL染料)浸泡然后放入摇床1h后，用TAE冲洗1-2次，再使用伯乐凝胶成像仪成像拍照，然后使用软件计算出其IC50。结果见图7和图13。

从图7和图13中，可以发现随着3-mis浓度不断增加，其对TopIA的抑制效果也越来越强，3-mis对TopIA的IC50：38nM。

实验例3

检测实施例3的具有5个错配碱基的环状闭合双链核苷酸(标记为5-mis)对TopIA的抑制作用。

(1)取7个1.5ml离心管分别编号1-7，1号管中最终包括50ng质粒PBR322，2-7管最终包含50mM KAc，20mM Tris-Ac，10mM Mg(Ac)2，100μg/mlBSA(pH 7.9@25℃)、50ng PBR322以及0.1U的TopIA，3-7号管再添加不同终浓度依次为170nM、85nM、42nM、22nM、10.5nM的5-mis。最后将各个管涡旋振荡仪上震荡数秒随后快速离心，将各管放入PCR仪37℃孵育30min。

(2)凝胶电泳实验：精确称取0.6g琼脂糖加入到锥形瓶中，随后加入60mlTAE缓冲液，均匀加热至澄清透明，随后将其缓慢倒入水平电泳槽内冷却成胶。

(3)在1-7管中加入2μL loading buffer，震荡离心，然后点样，电泳在100W条件下运行45min，待电泳结束后将凝胶取出在DNA染料的溶液中(100mlTAE+10μL染料)浸泡然后放入摇床1h后，用TAE冲洗1-2次，再使用伯乐凝胶成像仪成像拍照，然后使用软件计算出其IC50。结果见图8和图14。

从图8和图14中，可以发现随着5-mis浓度不断增加，其对TopIA的抑制效果也越来越强，5-mis对TopIA的IC50：17nM。

实验例4

检测实施例4的具有7个错配碱基的环状闭合双链核苷酸(标记为7-mis)对TopIA的抑制作用。

(1)取7个1.5ml离心管分别编号1-7，1号管中最终包括50ng质粒PBR322，2-7管最终包含50mM KAc，20mM Tris-Ac，10mM Mg(Ac)2，100μg/mlBSA(pH 7.9@25℃)、50ng PBR322以及0.1U的TopIA，3-7号管再添加不同终浓度依次为170nM、85nM、42nM、21nM、10.5nM的7-mis。最后将各个管涡旋振荡仪上震荡数秒随后快速离心，将各管放入PCR仪37℃孵育30min。

(2)凝胶电泳实验：精确称取0.6g琼脂糖加入到锥形瓶中，随后加入60mlTAE缓冲液，均匀加热至澄清透明，随后将其缓慢倒入水平电泳槽内冷却成胶。

(3)在1-7管中加入2μL loading buffer，震荡离心，然后点样，电泳在100W条件下运行45min，待电泳结束后将凝胶取出在DNA染料的溶液中(100mlTAE+10μL染料)浸泡然后放入摇床1h后，用TAE冲洗1-2次，再使用伯乐凝胶成像仪成像拍照，然后使用软件计算出其IC50。结果见图9和图15。

从图9和图15中，可以发现随着7-mis浓度不断增加，其对TopIA的抑制效果也越来越强，7-mis对TopIA的IC50：9nM。

实验例5

实施例1-4的环状闭合双链核苷酸的环状闭合结构验证实验

(1)成环验证，实验方法：分别取实施例1-4得到的环状闭合双链核苷酸产物，电泳，结果见图10。可以看出，与86bpd单链核苷酸(1/2/3/4/5)相比较，86bp的环状闭合双链核苷酸产物(5/6/7/8)电泳速度更慢，可以说明得到的环状闭合双链核苷酸是环状核苷酸。

(2)成环闭合验证，实验方法：分别取实施例1-4中的经T4连接酶、EXOI和EXOIII处理后的产物，电泳，结果见图11。

经过T4连接后可能出现：闭合环、有一个切口的环以及有两个切口的环。

验证闭合环，用EXOIII酶切(作用：本酶具有作用于双链DNA的3’→5’外切酶活性。本酶对双链结构具有高度特异性，能降解平滑末端、3’凹陷末端及有切口的DNA，但是不能降解3’突出末端。)，经过EXOIII切完，如果是非闭合环，产物将被降解，留下的就是需要的闭合环状DNA。用PAGE胶切胶回收试剂盒把目的条带回收。因此，该结果可以充分说明，本发明实施例1-4切胶回收的目的条带即为86bp环状闭合双链核苷酸。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种细菌I型拓扑异构酶抑制剂、抗菌药物和制备方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atcttcatcg aacaagaccc gtgcaatgct atcgacatca aggcctatcg cttgggagtc 60

aatgggttca ggatgcaggt gaggat 86

<210> 2

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccttgatgtc gatagcagtg cacgggtctt gttcgatgaa gatatcctca cctgcatcct 60

gaacccattg actcccaagc gatagg 86

<210> 3

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<210> 4

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列

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