基于身份标识性特征风味组分判别切达奶酪级别的方法

摘要

本发明公开了一种基于身份标识性特征风味组分判别切达奶酪级别的方法，包括以下步骤：选择不同级别的切达奶酪作为标准品，并从标准品中萃取挥发性风味物质；采用香气提取物稀释分析法结合气相‑嗅闻装置，从所述挥发性风味物质中筛选出风味强度较大的特征风味物质；对筛选得到的特征风味物质进行聚类，得到身份标识性特征风味组分；测定已知级别切达奶酪的身份标识性特征风味组分浓度，构建训练集，对支持向量机进行训练；测定待测切达奶酪的身份标识性特征风味组分浓度，输入至支持向量机中，对待测切达奶酪的级别进行判断。本发明通过统计分析得到切达奶酪身份标识性特征风味组分模型，在此基础上能够快速、准确判别切达奶酪品质级别。

说明书

技术领域

本发明涉及乳制品检测技术领域，尤其涉及一种基于身份标识性特征 风味组分判别切达奶酪级别的方法。

背景技术

风味是食品最重要的品质特征之一。食品中众多挥发性物质中，仅有 一小部分对总体风味的贡献较突出或起辅助作用。这些对产品风味起主导 作用的化合物被称为该食品的特征风味化合物。

奶酪(cheese)，又名干酪，是一种发酵的牛奶制品，其性质与常见 的酸牛奶有相似之处，都是通过发酵过程来制作的，也都含有可以保健的 乳酸菌，但是奶酪的浓度比酸奶更高，近似固体食物，营养价值也因此更 加丰富。

每公斤奶酪制品都是由10公斤的牛奶浓缩而成，含有丰富的蛋白质、 钙、脂肪、磷和维生素等营养成分，是纯天然的食品。就工艺而言，奶酪 是发酵的牛奶；就营养而言，奶酪是浓缩的牛奶。奶酪也是中国西北的蒙 古族，哈萨克族等游牧民族的传统食品，在内蒙古称为奶豆腐，在新疆俗 称乳饼，完全干透的干酪又叫奶疙瘩，世界出口奶酪最多的国家是荷兰。

切达奶酪(Cheddar)是一种原制奶酪，或称为天然奶酪，它是由原奶 经过灭菌，发酵，凝结，成熟等一系列复杂的加工工艺做成的。切达奶酪 是世界产量最大的奶酪，质地较软，很容易被融化，所以也可以作为调料 使用。其颜色从白色到浅黄不等，味道也因为储藏时间长短而不同，有的 微甜(9个月)、有的味道比较重(24个月)。

切达奶酪遵循美国农业部划分标准可分为三个级别，即根据切达奶酪 成熟时的风味、结构质地、颜色和完成度外观将切达奶酪分为淡味(mild or young)、中味(medium)、浓味切达(mature or strong)。

奶酪的风味与其品质有较大的相关性，其风味是影响其质量的关键因 素，不同等级的奶酪具有不同浓度的挥发性特征风味组分。奶酪的挥发性 组分包括脂肪酸、醇、醛、酯、酮、内酯、吡嗪、含硫化合物、胺等风味 活性物质。

目前，人工感官评定是确定和检验奶酪风味品质的有效手段。虽然人 工感官评定的方法可以对奶酪的风味品质进行区分，但存在差异性大、稳 定性低、缺乏数据支撑等缺点。

公开号为CN103822980A的中国专利文献公开了一种金华火腿品质的 快速判别方法，包括以下步骤：(1)金华火腿中风味成分的萃取，采用 固相微萃取技术萃取金华火腿中风味成分；(2)对金华火腿风味成分的 GC-MS分析，得到风味成分的GC-MS总离子流图，鉴定未知化合物；(3) 指纹图谱的建立；(4)快速判别。

但是，目前仍缺乏客观、有效的奶酪风味品质的鉴别方法。

发明内容

本发明提供了一种基于身份标识性特征风味组分判别切达奶酪级别 的方法，可利用仪器分析对切达奶酪的级别进行准确的判定。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种基于身份标识性特征风味组分判别切达奶酪级别的方法，包括以 下步骤：

(1)选择不同级别的切达奶酪作为标准品，并从标准品中萃取挥发 性风味物质；

(2)采用香气提取物稀释分析法结合气相-嗅闻装置，从所述挥发性 风味物质中筛选出风味强度较大的特征风味物质；

(3)对步骤(2)筛选得到的特征风味物质进行聚类，得到切达奶酪 的身份标识性特征风味组分；

(4)测定已知级别切达奶酪的身份标识性特征风味组分浓度，构建 训练集，采用训练集对支持向量机进行训练；

(5)测定待测切达奶酪的身份标识性特征风味组分浓度，输入至训 练好的支持向量机中，对待测切达奶酪的级别进行判断。

根据切达奶酪成熟时的风味、结构质地、颜色和完整度外观，将切达 奶酪分为淡味(mild or young)、中味(medium)、浓味(mature or strong) 三个级别。

本发明的判别方法先通过香气提取物稀释分析法(AEDA)结合气相- 嗅闻装置(GC-O)，筛选出切达奶酪中风味强度较大的特征风味物质， 再通过聚类算法对特征风味物质进行降维，筛选出对切达奶酪整体香气贡 献较大的风味物质作为切达奶酪的身份标识性特征风味组分，最后通过训 练样本的身份标识性特征风味组分浓度对支持向量机进行训练，采用支持 向量机对未知级别的切达奶酪进行判定。

步骤(1)中，切达奶酪标准品的级别分布为淡味、中味和浓味三个 等级。

采用溶剂辅助风味蒸发法(Solvent assisted flavor evaporation，SAFE) 对标准样品中的特征风味物质进行萃取。

奶酪的风味与其品质有较大的相关性，其风味是影响其质量的关键因 素，不同等级的奶酪具有不同浓度的挥发性特征风味组分。

步骤(2)中，香气提取物稀释分析法结合气相-嗅闻装置，从所述挥 发性风味物质中筛选出28种风味强度较大的特征风味物质，并采用 GC-MS对筛选出的特征风味物质进行定性。

进一步地，气相色谱条件为：采用氦气作载气，载气流速为1mL/min， 色谱柱为DB-WAX毛细管柱；色谱柱升温程序为：起始柱温35℃，保持 5min，溶剂延迟4min，以5℃/min升到100℃，保持2min，然后以6℃/min 升到180℃，最后以8℃/min升到230℃，保持2min；采用不分流模式， 进样口温度为250℃；

质谱条件为：采用电子电离源，电离能量为70eV，离子源温度为 230℃，接口温度为250℃，四极杆温度150℃，检测器温度为280℃，扫 描模式为全扫描，质量范围m/z 20～350。

28种特征风味物质包括酸性物质和中性/碱性物质；所述酸性物质为 乙酸、2-甲基-丙酸、丁酸、3-甲基-丁酸、戊酸、己酸、庚酸和壬酸；所 述中性/碱性物质为柠檬烯、癸醛、苯甲醛、月桂醛、2，3-丁二酮、2-庚酮、 2-壬酮、2-十一烷酮、呋喃酮、酱油酮、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、 癸酸乙酯、δ-己内酯、月桂酸乙酯、δ-壬内酯、δ-癸内酯、γ-十二内酯和δ-十二内酯。

为了进一步简化操作，需要对28种特征风味物质进行降维，从中筛 选出对切达奶酪整体香气贡献较大的风味物质。

优选的，在进行步骤(3)之前还包括：建立切达奶酪模拟体系，对 切达奶酪中特征风味物质含量进行缺失重组实验，剔除对切达奶酪整体香 气贡献较小的风味物质。

进一步地，剔除的对切达奶酪整体香气贡献较小的风味物质为乙酸和 壬酸。

步骤(3)通过聚类算法对特征风味物质进行聚类，从而对特征风味 物质进行降维。

优选的，步骤(3)中，采用K-means聚类算法对特征风味物质进行 聚类。

K-means聚类算法是很典型的基于距离的聚类算法，采用距离作为相 似性的评价指标，即认为两个对象的距离越近，其相似度就越大。其聚类 流程如下：(a)从n个数据对象任意选择k个对象作为初始聚类中心； (b)根据每个聚类对象的均值(中心对象)，计算每个对象与这些中心 对象的距离；并根据最小距离重新对相应对象进行划分；(c)重新计算 每个(有变化)聚类的均值(中心对象)；(d)循环(b)到(c)直到 每个聚类不再发生变化为止。

该聚类算法快速、简单，对大数据集有较高的效率并且是可伸缩的， 特别适用于本发明。

聚类中心数目的选择对聚类结果具有较大的影响。

优选的，设置K-means聚类算法的聚类中心数为2～12。将特征风味物 质聚为2～12类，并从中选择距离聚类中心最近的2～12个特征风味物质作为 切达奶酪的身份标识性风味物质时，支持向量机对切达奶酪的分类准确率 较高。

进一步地，设置K-means聚类算法的聚类中心数为2、4、5、6、7、8 或10；最优选的，设置K-means聚类算法的聚类中心数为6。

聚类中心数为2、4、5、、6、7、8或10时，支持向量机在训练样本上 的交叉验证得到的准确率和f1-score均在70％以上；特别是聚类中心数为6 时，支持向量机在训练样本上的交叉验证得到的准确率和f1-score均达到了 90％。

优选的，通过K-means聚类算法筛选出的身份标识性特征风味组分组 合包括：

辛酸乙酯和2-甲基-丙酸；

或，2-甲基-丙酸、丁酸、己酸乙酯、δ-壬内酯；

或，δ-壬内酯、2-甲基-丙酸、己酸、己酸乙酯、2，3-丁二酮；

或，δ-壬内酯、2-甲基-丙酸、己酸乙酯、丁酸、2，3-丁二酮、戊酸；

或，丁酸、苯甲醛、己酸乙酯、δ-壬内酯、2，3-丁二酮、3-甲基-丁酸、 戊酸；

或，己酸乙酯、δ-壬内酯、丁酸、3-甲基-丁酸、2，3-丁二酮、苯甲醛、 戊酸、庚酸；

或，苯甲醛、δ-壬内酯、丁酸、己酸乙酯、2，3-丁二酮、3-甲基-丁酸、 庚酸、2-甲基-丙酸、戊酸、δ-十二内酯。

进一步优选的，通过K-means聚类算法筛选出的身份标识性特征风味 组分组合为：δ-壬内酯、2-甲基-丙酸、己酸乙酯、丁酸、2，3-丁二酮和戊 酸。

步骤(4)和(5)中，采用气质联用测定已知级别切达奶酪和待测切 达奶酪的身份标识性特征风味组分浓度。

进一步地，气相色谱条件为：采用氦气作载气，载气流速为1mL/min， 色谱柱为DB-WAX毛细管柱；色谱柱升温程序为：起始柱温35℃，保持 5min，溶剂延迟4min，以5℃/min升到100℃，保持2min，然后以6℃/min 升到180℃，最后以8℃/min升到230℃，保持2min；采用不分流模式， 进样口温度为250℃；

质谱条件为：采用电子电离源，电离能量为70eV，离子源温度为230℃，接口温度为250℃，四极杆温度150℃，检测器温度为280℃，扫 描模式为全扫描，质量范围m/z 20～350。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

目前国内外对于切达奶酪分级主要依靠对奶酪制品熟悉的感官评价 员进行人工感官评定，该方法缺乏客观有效的数据支撑且耗时耗力，此外 对于切达奶酪基本靠进口的我国而言，缺乏相关感官评定人员导致我国切 达奶酪分级只能依赖进口产品标签，相对比较被动。本发明通过对切达奶 酪中特征风味组分进行精确的定性定量，依此建立数据库，统计分析得到 切达奶酪身份标识性特征风味组分模型，在此基础上通过本方法能够快速、准确判别切达奶酪品质级别，为进一步对市售切达奶酪快速鉴别及相 关检测奠定基础。

附图说明

图1为K-means聚类算法流程示意图；

图2为选择不同切达奶酪身份识别性特征风味组分的分类准确率及 fl-score。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是， 以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。

基于身份标识性特征风味组分判别切达奶酪级别的方法，包括以下步 骤：

1、切达奶酪样品特征风味组分数据库的建立

(1)切达标准样品的选择

选取9个市售切达奶酪样品，这些全部来自于世界上最大产量的奶酪 品牌，分别是美国的卡博特、爱尔兰的金凯利、荷兰的沃特堡，包括三个 级别，即淡味(mild oryoung)、中味(medium)、浓味切达(mature or strong)。 通过溶剂辅助风味蒸发(solventassisted flavor evaporation，SAFE)结合 气质联用仪测得各个级别奶酪中常见的挥发性风味组分，并结合描述性感 官实验分析得知每个切达奶酪级别中更易于被大家接受的奶酪样品，同时 通过电子鼻主成份分析得到整体风味更加接近的奶酪样品，由此三种方法综合筛选出淡味、中味、浓味3个级别各2种具有代表性的奶酪，作为之 后分析的6个切达奶酪标准样品。

(2)采用溶剂辅助风味蒸发法(SAFE)萃取切达奶酪标准样品挥发 性风味物质

将80g切碎后的切达奶酪和40g氯化钠称重，分装到两个250ml的 Teflon瓶中，并加入240ml无水乙醚和100μL浓度为0.816mg/mL 2-甲基 -3-庚酮和100μL浓度为0.931mg/mL 2-甲基戊酸，在4℃、180rpm下摇床 8h，过滤并收集，将萃取后的溶剂在鸡心瓶中氮吹至200ml。

溶剂辅助风味蒸发装置独立连接200ml接收瓶和1000ml废液瓶，前 体泵结合分子涡轮泵作为真空系统，保持滴液漏斗和冷陷水平方向一致， 杜瓦瓶和冷陷中一直充满液氮。

将溶剂萃取得到200ml浸提液倒入SAFE装置并逐渐引入真空，直到 所有的浸提液都置于真空条件，在真空条件下蒸馏约3h(约10^-4Torr)，>

将醚层继续用2ml饱和氯化钠溶液洗涤3次，所有洗涤步骤都要充分 混匀溶液，并将5次分离的水相收集到同一个具塞锥形瓶中。剩余收集层 (醚层)为中性/碱性(N/B)。

用18％(wt/vol)的盐酸酸化水相的pH至2.0～2.5，回收酸性挥发物 (AC)。酸化后的水相用5ml无水乙醚萃取3次，去除残留水相。

将含有中/碱性化合物和酸性化合物的醚层分别用无水硫酸钠干燥，过 滤放入鸡心瓶中并静置于-20℃冰箱冷藏12小时左右，待水处理彻底后， 在温和的氮气流下吹至各1ml，进GC-MS分析。

取1μL SAFE提取物用于气相色谱质谱联用分析。GC条件为：采用 DB-WAX毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)，氦气作载气，载气流速为 1mL/min。色谱柱升温程序为起始柱温35℃，保持5min，溶剂延迟4min， 以5℃/min升到100℃，保持2min，然后以6℃/min升到180℃，最后以8℃ /min升到230℃，保持2min。采用不分流模式，进样口温度为250℃。

质谱条件为：电子电离源，电离能量为70eV，离子源温度为230℃， 接口温度为250℃，四极杆温度150℃，检测器温度为280℃，扫描模式为 全扫描，质量范围m/z 20～350。

数据处理由MassHunter化学工作站完成，待鉴定化合物经检索与 NIST 14谱库中该挥发性成分在DB-WAX毛细管柱分析的文献报道中保 留指数进行对比，仅当匹配度大于800的鉴定结果才予以列出，定性分析 所得挥发性化合物，并根据内标浓度对化合物进行定量。

(3)采用香气提取物稀释分析法(AEDA)测定特征风味组分

将溶剂辅助风味蒸发法(SAFE)得到的浓缩液用正己烷按3ⁿ(n＝1，>

每个稀释倍数的样品由感官评价员分析三次，有两次以上在同一嗅闻 时间有相同感官描述即为有效结果，最后确定得到风味强度较大的28种 风味组分，见表1。

表1 AEDA法确定不同切达奶酪中的活性香气物质

注：a为GC-O期间在嗅探端口感知的气味质量；b中N/B表示中性/碱性化合物；AC表示 酸性化合物；c为保留指数；d为风味稀释因子；f中MS即质谱(化合物通过质谱鉴定)，O指参照化合物的气味描述与评价员描述比较，Std指参考标准化合物。

(4)特征风味组分的精确定量

(A)特征风味组分标准曲线的建立

将AEDA法选出的28种特征风味组分的标准品，在其浓度大致范围 内(根据预实验大概测量过浓度范围)，选择14点浓度计算标准曲线(最 小R²＞0.92)。

即将标准品化合物溶于正己烷中，按浓度梯度配置(见表2)溶液， 将配好的标准品溶液放置4℃冰箱2小时后备用。

取1μL标准品溶液进GC-MS分析，GC-MS条件同上述。通过将恒定 含量的内标分别加到不同浓度的外标溶液里，计算出不同浓度下的校正因 子，算出平均值；利用外标线性回归方程，根据内标半定量结果计算出奶 酪样品中特征风味物质的含量，再用校正因子校正。

表2标准品浓度梯度配置

(b)切达奶酪的28种化合物的测定及特征风味组分数据库的建立

建立切达奶酪模拟体系，根据28种化合物的外标含量向模拟体系的 基底中加入标准品，对标准切达奶酪样品中风味物质含量进行缺失重组实 验，重组样品及奶酪样品风味剖面图轮廓接近，说明风味物质外标定量结 果较准确。

乙酸和壬酸省略组与完全重组样品比较没有显著差异，排除乙酸和壬 酸作为最重要的香气贡献。

为扩充样品库及其对应的特征风味组分数据库，一共采集了27个市 售切达奶酪，其中包含6种未知级别奶酪，21个已知级别切达奶酪作为样 品库奶酪，用同样的前处理方法，即溶剂辅助风味蒸发发萃取奶酪中风味 物质，外标法定量，根据不同奶酪样品的定量结果建立特征风味组分数据 库，结果见表3。

表3中样品1～9为淡味切达奶酪，10～18为中味切达奶酪，18～21为 浓味切达奶酪。

2、生成身份标识性特征风味组分模型

根据28个特征化合物在不同级别切达奶酪中的含量差别，用K-means 聚类法对表3中28个特征化合物进行聚类分析，分成若干簇，距离簇中 心最近的几个特征化合物即为身份标识性特征风味化合物，身份标识性特 征风味化合物可用于切达奶酪样本的级别判定，这样将减少特征风味组分 个数，提高分类效率以及准确度，步骤如下：

(1)风味组分浓度数据：21个已知级别的切达奶酪样本的28种特征 风味组分定量结果如表3示，其中样本级别分布为：淡味、中味、浓味。

(2)根据28个特征化合物在不同级别切达奶酪中的含量差别，对表 3中不同级别的28种特征风味组分进行K-means聚类，主要参数是聚类 簇的个数K，以切达奶酪样本级别判定的准确率(accuracy)和fl-score 作为评价指标确定最终的K值，聚类流程图如图1，输出结果为簇划分 C＝{C1，C2，...，Ck}，计算距离K个簇中心最近的K个风味组分，根据不同的K值得到不同的身份标识性特征风味组分组合，如表4。

表4不同的切达奶酪身份标识性特征风味细分

3、未知切达奶酪级别的判定

利用支持向量机(Support Vector Machine，SVM)模型判别未知切达 奶酪级别。

根据表4保留不同的切达奶酪身份标识性特征风味组分，将21个样 本输入支持向量机模型分类，通过交叉验证(CV＝5)得到准确率和f1-score，f1-score是精确率(precision)和召回率(recall)的一种调和平 均数，越高说明分类模型性能越好.

如图2，当簇个数为6时，切达奶酪特征风味组分为δ-壬内酯、2-甲 基-丙酸、己酸乙酯、丁酸、2，3-丁二酮和戊酸时，分类器效果最好，准确 率、fl-score均高达90％，能够很好的区分负样本和识别正样本，判定未 知的切达奶酪级别。

保留δ-壬内酯、2-甲基-丙酸、己酸乙酯、丁酸、2，3-丁二酮和戊酸作 为切达奶酪的身份标识性特征风味组分，将21个样本输入支持向量机模 型，对支持向量机进行训练。

测定未知级别的切达奶酪中δ-壬内酯、2-甲基-丙酸、己酸乙酯、丁酸、 2，3-丁二酮和戊酸的浓度，输入至训练好的支持向量机中，对该切达奶酪 的级别进行判定。

以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明， 应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡 在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在 本发明的保护范围之内。