精子染色质结构检测试剂盒及其应用

摘要

本发明是关于一种精子染色质结构检测试剂盒及其应用，精子染色质结构检测试剂盒包括：A试剂和B试剂；所述的A试剂包括：HCl、吐温‑20和磷酸盐缓冲液；所述的B试剂包括：吖啶橙和水。本发明的精子染色质结构检测试剂盒用于人体精子染色质DNA的染色，判断染色质DNA碎裂水平和计算发生DNA碎裂的精子比例，同时还可通过染色质与蛋白结合的程度分析未成熟精子的比例。

说明书

技术领域

本发明涉及一种医药技术领域，特别是涉及一种精子染色质结构检测试剂盒及其应用。

背景技术

最新的世界卫生组织统计数据显示，在已婚夫妇中，非意愿性不孕不育的平均发生率为7％-46％，并呈逐年增加的趋势。不孕的原因，有一半是男性因素引起的，临床上把男性不育分为性功能障碍和性功能正常两类，后者依据精液分析结果可进一步分为无精子症、少精子症、弱精子症、精子无力症和精子数正常性不育。精子DNA碎片化程度被认为是一个新的评价精液质量和预测生育能力的指标，男性不育患者的精子DNA碎片会明显增多，精子DNA的完整性是判断精子质量的有效依据。精子DNA碎片化程度反映精子遗传物质的完整性，精子DNA发生碎片化会对生育产生负面影响，造成不育和反复流产。男性患者的初步评估大多采用传统的精液分析(SA)，但很难评估生育潜力。哺乳动物受精和随后的胚胎发育是否正常，取决于精子DNA是否完整。正常情况下，精子DNA与鱼精蛋白结合，天然存在于致密状态，保护其免于破坏，即使可能发生一些损伤，也可以在卵母细胞的细胞质中修复。然而，当损害超过细胞质的修复阈值时，可能会导致不孕，因此，精子分子结构完整性对于评估生育潜力非常有必要。

体外和体内研究都表明精子DNA完整性是精子发生和雄性生育潜力完整性的标志，与生育率负相关。

正常生育男性精子中约有10％存在DNA损伤，DNA损伤大于30％则精子完整性较差。

常用的精子DNA碎裂检测方法有不少，包括苯胺蓝染色、色霉素A3染色、甲苯胺蓝染色、TUNEL法、Comet试验等等，但要么步骤复杂，要么效率低下且准确性和稳定性差。为此，我们制备了一种精子染色质结构检测试剂盒，实现快速、高效、客观、稳定检测精子染色质结构和DNA完整性。

目前，临床上诊断男性不育症，通常是通过对精子的数量、活性、形态、运动能力等指标，以及对精子的穿卵能力和膜功能进行评估。然而，以上的检测方法无法全面评估男性的生育能力，大约有15％的男性不育患者其常规精液检查是正常的。因此，精子染色质完整性检测在男性不育患者的诊断中显得尤为重要。

检测精子染色质完整性的方法包括：精子染色质结构分析(Sperm ChromatinStructure Assay，SCSA)，末端脱氧核苷酸转移酶接到的脱氧尿苷磷酸标记法，彗星实验，精子染色体扩散实验，吖啶橙实验，甲苯胺蓝染色，色霉素A3染色法和荧光原位杂交技术等。其中，SCSA是目前检测精子染色质完整性最常用的方法之一，其原理是：当精子正常时，DNA呈紧密结合的双链，吖啶橙透过细胞膜与之结合，但结合形式大多呈单体，发出绿色荧光。而当精子DNA发生碎裂时，其在酸的作用下会变性成单链，此时结合的吖啶橙分子数量会增多，可呈聚合物形式发出红色或黄色荧光。

现有技术的检测精子染色质的检测盒具有以下缺点：1)组成复杂，由3-4种组份组成，其中每种组份由多种试剂配制而成，检测过程中实验步骤繁琐，耗时长；2)无法用上流式细胞仪进行检测。大部分已有产品只能通过荧光显微镜进行染色观察，只能对精子核碎片的数量进行观察，无法分析碎片程度和未成熟精子的比例；3)已有产品中即使可以通过流式细胞仪的方法进行检测，但产品组份较多，样本处理复杂，且后续的数据分析仅能通过其特有的软件进行，无法用常规流式软件进行分析。

发明内容

本发明的主要目的在于，提供一种新型的精子染色质结构检测试剂盒及其应用，所要解决的技术问题是使其简化检测步骤及操作时间，从而更加适于使用。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种精子染色质结构检测试剂盒，其包括：A试剂和B试剂；

所述的A试剂包括：HCl、吐温-20和磷酸盐缓冲液；

所述的B试剂包括：吖啶橙和水。

本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。

优选的，前述的精子染色质结构检测试剂盒，其中所述的A试剂中HCl的重量百分比为0.1-1％。

优选的，前述的精子染色质结构检测试剂盒，其中所述的A试剂中吐温-20的重量百分比为0.1-0.5％。

优选的，前述的精子染色质结构检测试剂盒，其中所述的A试剂的pH为1-4。

优选的，前述的精子染色质结构检测试剂盒，其中所述的B试剂中吖啶橙的浓度为0.01-100ug/mL。

优选的，前述的精子染色质结构检测试剂盒，其中所述的A试剂与B试剂的体积比为1:6-2:1。

本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。依据本发明提出的一种精子染色质结构检测试剂盒的应用，将前述的精子染色质结构检测试剂盒用于检测染色质DNA碎裂程度和未成熟精子的比例，其包括：

向精子样本中依次加入A试剂和B试剂，混合，过滤，进行观察分析。

本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。

优选的，前述的精子染色质结构检测试剂盒的应用，其中所述的精子样本与A试剂的体积比为1:20-1:2。

优选的，前述的精子染色质结构检测试剂盒的应用，其中所述的A试剂与B试剂的体积比为1:6-2:1。

优选的，前述的精子染色质结构检测试剂盒的应用，其中所述的观察分析为荧光显微镜分析或流式细胞仪分析。

借由上述技术方案，本发明精子染色质结构检测试剂盒及其应用至少具有下列优点：

1)本发明的精子染色质结构检测试剂盒仅由两种试剂组成，简化检测步骤及操作时间；并且试剂没有腐蚀性，也没有氧化性，可以装于多种材质的容器，如玻璃容器或塑料容器等；

2)本发明的精子染色质结构检测试剂盒用于人体精子染色质DNA的染色，判断染色质DNA碎裂水平和计算发生DNA碎裂的精子比例，同时还可通过染色质与蛋白结合的程度分析未成熟精子的比例；

3)本发明的精子染色质结构检测试剂盒既可以通过荧光显微镜方法进行观察分析，也可以上流式细胞仪进行分析，并且对分析软件没有限制，极大地方便了临床及科研工作者。除了常见的碎片分析，还可以分析碎片程度和未成熟精子比例。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的精子染色质结构检测试剂盒及其应用其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。

本发明的一个实施例提出的一种精子染色质结构检测试剂盒，其包括：A试剂和B试剂；

所述的A试剂包括：HCl、吐温-20(Tween-20)和磷酸盐缓冲液(PBS)；

所述的B试剂包括：吖啶橙和水。

优选的，A试剂中HCl的重量百分比为0.1-1％；

A试剂中吐温-20的重量百分比为0.1-0.5％。

A试剂的pH为1-4。

优选的，B试剂中吖啶橙的浓度为0.01-100ug/mL。

优选的，A试剂与B试剂的体积比为1:6-2:1。

A试剂和B试剂没有腐蚀性，也没有氧化性，可以装于多种材质的容器，如玻璃容器或塑料容器。

精子染色质结构检测试剂盒于2-8℃避光保存。

较佳的，本发明的另一实施例提出一种精子染色质结构检测试剂盒的应用，将前述的精子染色质结构检测试剂盒用于检测染色质DNA碎裂程度和未成熟精子的比例，其包括：

向精子样本中加入A试剂，室温孵育，再加入B试剂，室温孵育，过滤，进行观察分析。

优选的，精子样本与A试剂的体积比为1:20-1:2。

优选的，A试剂与B试剂的体积比为1:6-2:1。

优选的，观察分析为荧光显微镜分析或流式细胞仪分析。

将精子样本与A试剂和B试剂混合后进行过滤和/或分装的步骤。分装规格可以为10人份/盒、20人份/盒、50人份/盒等。

精子样本的保存条件需2-8℃保存8小时以内，或保存在特定保存试剂内，或液氮保存。

实施例1

本发明的一个实施例提出的一种精子染色质结构检测试剂盒，其包括：A试剂和B试剂；

其中，A试剂的制备方法为：盐酸1g，吐温-20 0.5g，加入PBS 90ml，调节pH为1，定容至100ml，装入密封试剂瓶内，得到A试剂，并进行分装。

B试剂的制备方法为：称取10mg吖啶橙溶于100ml纯化水或蒸馏水中，充分溶解，得到B试剂，并进行分装。

本发明的另一实施例提出一种精子染色质结构检测试剂盒的应用，将实施例1的精子染色质结构检测试剂盒用于检测染色质DNA碎裂程度和未成熟精子的比例，其包括：

取流式管，加入用PBS稀释至浓度为1×10⁶个/ml的精子样本100uL；再向管内加入200uL的A试剂，使用漩涡振荡器充分混匀后，室温孵育30秒；再向管内加入1mL>

以200目过滤器材对混合样本进行过滤，待用；

将混合样本均匀分布于玻片，通过配置有488nm激发波长的荧光显微镜进行观察，根据样本颜色进行分析，绿色荧光表示DNA完整、染色质结构正常精子，红色或黄色荧光代表DNA碎裂、染色质结构不完整的精子。

实施例2

本发明的一个实施例提出的一种精子染色质结构检测试剂盒，其包括：A试剂和B试剂；

其中，A试剂的制备方法为：盐酸1g，吐温-20 0.1g，加入PBS 90ml，调节pH为1，定容至100ml，装入密封试剂瓶内，得到A试剂，并进行分装。

B试剂的制备方法为：称取1mg吖啶橙溶于100ml纯化水或蒸馏水中，充分溶解，得到B试剂，并进行分装。

本发明的另一实施例提出一种精子染色质结构检测试剂盒的应用，将实施例2的精子染色质结构检测试剂盒用于检测染色质DNA碎裂程度和未成熟精子的比例，其包括：

取流式管，加入用PBS稀释至浓度为1×10⁶个/ml的精子样本100uL；再向管内加入400uL的A试剂，使用漩涡振荡器充分混匀后，室温孵育30秒；再向管内加入1mL>

以200目过滤器材对混合样本进行过滤，待用；

将混合样本通过流式细胞仪上机，利用FL1/FL2分析数据结果。

实施例3

本发明的一个实施例提出的一种精子染色质结构检测试剂盒，其包括：A试剂和B试剂；

其中，A试剂的制备方法为：盐酸1g，吐温-20 0.1g，加入PBS 90ml，调节pH为4，定容至100ml，装入密封试剂瓶内，得到A试剂，并进行分装。

B试剂的制备方法为：称取0.1mg吖啶橙溶于100ml纯化水或蒸馏水中，充分溶解，得到B试剂，并进行分装。

本发明的另一实施例提出一种精子染色质结构检测试剂盒的应用，将实施例3的精子染色质结构检测试剂盒用于检测染色质DNA碎裂程度和未成熟精子的比例，其包括：

取流式管，加入用PBS稀释至浓度为1×10⁶个/ml的精子样本200uL；再向管内加入200uL的A试剂，使用漩涡振荡器充分混匀后，室温孵育30秒；再向管内加入1mL>

以200目过滤器材对混合样本进行过滤，待用；

将混合样本通过流式细胞仪上机，利用FL1/FL3分析数据结果。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。