油菜黑胫病菌亚种的特异性序列在油菜黑胫病菌检测中的应用

摘要

本发明属于植物保护技术领域，公开了油菜黑胫病菌亚种的特异性序列在油菜黑胫病菌检测中的应用，本发明提供了L.biglobosa ‘brassicae’（Lbb）特异性检测靶标，该靶标具备特异好、稳定性强和灵敏度高的特点，对于有着较高的同源性油菜黑胫病菌近缘种和亚种都能很好的区分，避免了假阳性的产生。针对该靶标设计的LAMP引物，可以检测到132fg/μL的L.biglobosa ‘brassicae’基因组DNA，为油菜黑胫病菌亚种Lbb快速检测和鉴定提供了一种灵敏快速的工具。

说明书

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及油菜黑胫病菌亚种的特异性序列在油菜黑胫病菌检测中的应用。

背景技术

油菜黑胫病(Blackleg)是一种世界性的油菜病害。据报道，在每个油菜生产季，造成的全世界经济损失高达9亿美元以上(Fernando et al.,2016)，其病原菌是小球腔菌属真菌，可严重危害油菜等十字花科植物。小球腔菌属(Leptosphaeria)真菌包括两个近缘种：L.ma culans和L.biglobosa(Shoemaker and Brun.,2001)(Kaczmarek.,2009)。这两种病原菌在加拿大、澳大利亚、欧洲均有分布(West et al.,2001)，而我国目前仅报道了L.bigl obosa，尚没有发现L.maculans。因此，我国于2007年5月28日将L.maculans列为我国禁止进境的植物检疫性病原菌(周国梁，2010；周圆等，2016)。

油菜黑胫病菌包括了六个亚种或亚类，即L.biglobosa‘brassicae’(在本发明中简写为Lbb)、L.biglobosa‘canadiensis、’L.biglobosa‘australensis、’L.biglobosa‘occiaustralensis、’L.biglobosa‘thlaspii’和L.biglobosa‘erysimii’，其中，L.biglobosa‘canadiensis’是加拿大的优势种群，L.biglobosa‘brassicae’是东欧和亚洲的优势种群(Mendes-Pereira et al 2003；Vincenot et al 2008)。造成我国油菜黑胫病的主要是L.biglobosa‘brassicae’(Liu et al.,2014)。油菜黑胫病菌主要侵染油菜茎部，在侵染部位形成黄褐色的裂口病斑，严重时造成茎秆倒伏，严重威胁着油菜的生产安全。目前，对于油菜黑胫病的防治，主要还是依靠对油菜产区进行重点监测，及时掌握病害危害和病原菌小种变化趋势，据此建立统防统治的防控体系(荣松柏等，2018)。现在已经有AFLP及ISSR等方法应用到油菜黑胫病菌亚种的检测鉴定工作中(Liu et al.,2014；郝丽芬等，2014)。但是，现存的检测方法周期长、对仪器设备以及工作人员要求高、检测步骤繁杂等劣势，难以满足田间的实时快速检测的要求。因此，一种快速、准确、灵敏简便的检测技术对于口岸检测油菜黑胫病菌显得尤为重要。

针对上述问题，本发明提供了油菜黑胫病菌Lbb特异性序列，该序列在油菜黑胫病菌中特异性存在，能对近缘种及亚种进行很好的区分；同时针对该序列，设计了油菜黑胫病菌Lbb的特异性LAMP检测引物，建立一种适用于田间的LAMP快速检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供了油菜黑胫病菌亚种的特异性序列在油菜黑胫病菌检测中的应用，所述的油菜黑胫病菌亚种的特异性序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了检测SEQ ID NO.1所示序列的试剂在制备油菜黑胫病菌检测试剂中的应用。

本发明的还有一个目的在于提供了针对SEQ ID NO.1所示序列设计的引物在制备油菜黑胫病菌检测试剂中的应用。

本发明还有一个目的在于提供了针对油菜黑胫病菌亚种的特异性序列设计的LAMP引物，所述的引物为F3:5’-GTATTGGCCGCGAATTCC-3’、B3:5’-GGAGATTGGCCACTATGG-3’、FIP:5’-GGCGTCTCTTTTATGGCTATTTTCTGGTCAAAAGTTGGTTTGGA、BIP:5’-AATGTCAGGAAGTCTGAAAAGCTCACGTTCTCTGATCAGGAC-3’、LF:5’-CCGAAATGAATTGTACCAGTATCCT-3’、LB:5’-ACTGCCTCATGCAACATGG-3’。

为了达到以上目的，本发明采取以下技术措施：

SEQ ID NO.1所示序列在油菜黑胫病菌L.biglobosa‘brassicae’(Lbb)检测中的应用，只要该序列应用于L.biglobosa‘brassicae’的检测，都属于本发明的保护内容。

检测SEQ ID NO.1所示序列的试剂在制备油菜黑胫病菌检测试剂中的应用，包括针对SEQ ID NO.1所示序列设计的引物在制备油菜黑胫病菌检测试剂中的应用，只要针对该序列设计的引物用于油菜黑胫病菌的检测，都属于本发明的保护内容。

以上所述的应用中，优选的，针对SEQ ID NO.1所示序列设计的LAMP引物，所述的引物为：F3:5’-GTATTGGCCGCGAATTCC-3’、B3:5’-GGAGATTGGCCACTATGG-3’、FIP:5’-GGCGTCTCTTTTATGGCTATTTTCTGGTCAAAAGTTGGTTTGGA、BIP:5’-AATGTCAGGAAGTCTGAAAAGCTCACGTTCTCTGATCAGGAC-3’、LF:5’-CCGAAATGAATTGTACCAGTATCCT-3’、LB:5’-ACTGCCTCATGCAACATGG-3’。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明提供了L.biglobosa‘brassicae’的特异性检测靶标，在申请日之前，还从未有此相关报道。该靶标具备特异好、稳定性强和灵敏度高的特点，对于有着较高的同源性油菜黑胫病菌近缘种和亚种能很好的区分，避免了假阳性的产生。

2.针对L.biglobosa‘brassicae’的特异性序列设计了LAMP引物，由于LAMP引物的设计需要结合靶序列上的六个区域，可以精确检测到油菜黑胫病菌Lbb的存在，可以检测到132fg/μL的Lbb基因组DNA，而常规的PCR(F3:5’-TATTGGCCGCGAATTCC-3’、B3:5’-GGAGATTGGCCACTATGG-3’)只能检测到1.32ng/μL。

3.本发明的提供的检测引物具有特异好、灵敏度高、稳定性强和快速简便的优点，在检测过程中很好地控制了假阳性的出现，同时又可以精确检测到L.biglobosa‘brassicae’的存在。这为油菜黑胫病菌的田间检测，以及该病害的田间监测鉴定等提供了很好的工具。

附图说明

图1为油菜黑胫病菌LAMP检测引物特异性检测可视化图及凝胶电泳图；

其中上图：1-21管：21株采自全国的L.biglobosa‘brassicae’菌株(具体顺序见表1)，22-23管：2株亚种L.biglobosa'canadensis'，24-35管：2株近缘种L.maculans，10株在油菜上分离得到的病原真菌(依次是：Phoma sp.、Phoma macrostoma、Phoma sp.、Phomaglomerata、Phoma herbarum、Botrytis cinerea、Sclerotinia sclerotiorum、Colletotrichum sp.、Alternaria alternata、Chaetomiumglobosum，)，第36管：阴性对照；

下图：凝胶电泳图：泳道M:100bp DNALadder，泳道1：L.biglobosa‘brassicae’W10，泳道2-15：对应表1中的22-35号菌株，泳道16：阴性对照，水；

图2为油菜黑胫病菌LAMP检测引物灵敏度检测可视化图及凝胶电泳图；

上图为油菜黑胫病菌L.biglobosa‘brassicae’的检测可视化图，其中1-9管的油菜黑胫病菌L.biglobosa‘brassicae’W10，DNA浓度分别为：132ng/μL、13.2ng/μL,1.32ng/μL,132pg/μL,13.2pg/μL,1.32pg/μL,132fg/μL,13.2fg/μL,1.32fg/μL，第10管:阴性对照；

下图为油菜黑胫病菌L.biglobosa‘brassicae’的扩增产物凝胶电泳图，其中泳道M:100bp DNA Ladder，1-9：132ng/μL、13.2ng/μL,1.32ng/μL,132pg/μL,13.2pg/μL,1.32pg/μL,132fg/μL,13.2fg/μL,1.32fg/μL的油菜黑胫病菌L.biglobosa‘brassicae’的基因组DNA，10:阴性对照。

图3为油菜黑胫病菌特异性LAMP检测引物检测田间油菜茎秆可视化图及凝胶电泳图；

上图：1-7管：田间采集发病油菜茎秆DNA，8-13管:未显症状油菜茎秆DNA；

下图：泳道M:100bp DNA Ladder,1-7:田间采集发病油菜茎秆DNA，8-13:未显症状油菜茎秆DNA。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或材料，如未特别说明均为公众可获得的。

实施例1：

SEQ ID NO.1所示序列或针对该序列设计的引物在检测油菜黑胫病菌(L.biglobosa‘brassicae’)中的应用：

针对SEQ ID NO.1所示序列，设计了LAMP引物，如下：

F3:5’-GTATTGGCCGCGAATTCC-3’

B3:5’-GGAGATTGGCCACTATGG-3’

FIP:5’-GGCGTCTCTTTTATGGCTATTTTCTGGTCAAAAGTTGGTTTGGA-3’

BIP:5’-AATGTCAGGAAGTCTGAAAAGCTCACGTTCTCTGATCAGGAC-3’

LF:5’-CCGAAATGAATTGTACCAGTATCCT-3’

LB:5’-ACTGCCTCATGCAACATGG-3’。

LAMP扩增体系如下：

Bst 2.0WarmStart DNA Polymerase购买自New England Biolabs公司。

LAMP扩增程序如下：

65℃反应40min；80℃灭活5min

在反应产物中加入1000×SYBR Green I，阳性反应显示荧光绿色，表明有油菜油菜黑胫病菌L.biglobosa‘brassicae’的存在；阴性对照保持橙色。

实施例2：

油菜黑胫病菌(L.biglobosa‘brassicae’)LAMP引物特异性检测及灵敏度检测：

油菜黑胫病菌(L.biglobosa‘brassicae’)LAMP引物特异性检测：

共选取了35个菌株样本，对本发明提供的引物进行特异性检测：

21株采自全国冬油菜产区的L.biglobosa‘brassicae’菌株；2株亚种L.biglobosa'c anadensis'；2株近缘种L.maculans；10株在油菜上分离得到的病原真菌(依次是：Phoma sp.、Phoma macrostoma、Phoma sp.、Phoma glomerata、Phoma herbarum、Botrytis cinerea、Sclerotinia sclerotiorum、Colletotrichum sp.、Alternariaalternata、Chaetomium globosum)，所有菌株如表1所示。

利用实施例1所述的方法，对表1中所述菌株进行了LAMP检测。表1中“+”表示结果阳性，“-”表示结果阴性。

表1

油菜黑胫病LAMP引物灵敏性检测

将油菜黑胫病菌Lbb(W10)的基因组DNA进行10倍浓度梯度稀释，用本发明提供的LAMP引物检测其灵敏性。结果表明，该组引物可以检测到最低浓度为132fg/μL的油菜黑胫病菌DNA，灵敏性较强(图2)。

实施例3：油菜黑胫病菌LAMP特异性检测引物的田间应用

在全国油菜产区(湖北赤壁、湖北咸宁、内蒙范三、甘肃民乐、西宁互助、内蒙免渡河、陕西汉中、湖南怀化、浙江宁波、贵州贵阳等地)采集发病的油菜茎秆，从中随机选取7株油菜黑胫病明显发病的茎秆和6株未显症状的油菜茎秆，对发病组织提取DNA，用本发明提供的LAMP引物进行LAMP检测，结果显示，7株发病油菜茎秆上均检测到了油菜黑胫病菌Lbb的存在，而6株未显症状的油菜茎秆上检测到2株油菜茎秆也有油菜黑胫病菌Lbb的存在，只有4株未检测到该病菌的存在(图3)，将2株未显症状检测结果为阳性的油菜茎秆保湿培养于25℃的环境中，7天以后观察到有黑胫病典型的褐色病斑出现，表明此LAMP引物可以用于检测油菜病组织中的L.biglobosa'brassicae'。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 油菜黑胫病菌亚种的特异性序列在油菜黑胫病菌检测中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 615

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tataaagggt agttacaatg aaaacttaac ttgagagcag ctcatataag tgttgattga 60

ggaaagtttg atcgaaatag caattataca gtgctttggt cagacaatgt agaagctggc 120

tatgcgagac aagcatatgt tttattgctt gctcttagac atgttccaga atgctgttcc 180

cgcctagacc tggtaggcta gattgctagg gccattgcga tgtgacgcac gcgtttggtc 240

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cgcttcgtat taggtatgtg tgccaatgaa agttgccgac atggacaaca cgaacacctt 540

gataccaatg ttattagcgt catatccaat ttagtgagca ttcagtgggt ctgttattgc 600

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<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtattggccg cgaattcc 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcgtctctt ttatggctat tttctggtca aaagttggtt tgga 44

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatgtcagga agtctgaaaa gctcacgttc tctgatcagg ac 42

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgaaatgaa ttgtaccagt atcct 25

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

actgcctcat gcaacatgg 19