油菜黑胫病菌加拿大亚种Lbc的特异性序列在油菜黑胫病菌检测中的应用

摘要

本发明属于植物保护技术领域，公开了油菜黑胫病菌亚种的特异性序列在油菜黑胫病菌检测中的应用，本发明提供了L.biglobosa'canadensis'（Lbc）特异性检测靶标，该靶标具备特异好、稳定性强和灵敏度高的特点，对于有着较高的同源性油菜黑胫病菌近缘种和亚种都能很好的区分，避免了假阳性的产生。针对该靶标设计的LAMP引物，可以检测到988fg/μL的L.biglobosa‘canadensis’基因组DNA，为油菜黑胫病菌亚种Lbc快速检测和鉴定提供了一种灵敏快速的工具。

说明书

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及油菜黑胫病菌亚种的特异性序列在油菜黑胫病菌检测中的应用。

背景技术

油菜黑胫病(Blackleg)是一种世界性的油菜病害。据报道，在每个油菜生产季，造成的全世界经济损失高达9亿美元以上(Fernando et al.,2016)，其病原菌是小球腔菌属真菌，可严重危害油菜等十字花科植物。油菜黑胫病菌主要侵染油菜茎部，在侵染部位形成黄褐色的裂口病斑，严重时造成茎秆倒伏，严重威胁着油菜的生产安全。小球腔菌属(Leptosphaeri a)真菌包括两个近缘种：L.maculans和L.biglobosa(Shoemaker andBrun,2001；Kaczmar ek,2009)。这两种病原菌在加拿大、澳大利亚、欧洲均有分布(West etal.,2001)，而我国目前仅报道了L.biglobosa，尚没有发现L.maculans。因此，我国于2007年5月28日将L.maculans列为我国禁止进境的植物检疫性病原菌(周国梁，2010；周圆等，2016)。

油菜黑胫病菌包括了六个亚种或亚类，即L.biglobosa‘brassicae’(在本发明中简写为L bb)、L.biglobosa‘canadensis’(在本发明中简写为Lbc)、L.biglobosa‘australensis’、L.big lobosa‘occiaustralensis’、L.biglobosa‘thlaspii’和L.biglobosa‘erysimii’，其中，L.biglobosa‘canadensis’是加拿大的优势种群，L.biglobosa‘brassicae’是东欧和亚洲的优势种群(Mendes-Pereira et al.,2003；Vincenot et al.,2008)。长久以来在我国的油菜主产区仅发现了L.bi globosa‘brassicae’这一个亚种，尚没有其他亚种的报道。

申请人在我国春油菜产区首次发现了另一油菜黑胫病的亚种L.biglobosa‘canadensis’。病原菌小种的变化以及发展趋势，是我们防治油菜黑胫病对油菜生产区进行监测的重点，同时也是我们建立统防统治防控体系的重要依据(荣松柏等，2018)。Lbc和Lbb同属于Lb的亚种，不仅种间亲缘关系近，与近缘种Lm也具有亲缘性，这给特异性检测Lbc带来一定的挑战。同时，目前鲜有对于Lbc的研究报道，其全基因组也还未公布。对Lbc的特异性检测的报道，目前仅有HaeⅢ酶切技术(Mendes-Pereira et al.,2003)，但是该技术周期长、对仪器设备以及工作人员要求高、检测步骤繁杂，难以满足田间的实时快速检测的要求。因此，一种快速、准确、灵敏简便的检测技术对于田间快速检测油菜黑胫病菌Lbc显得尤为重要。

针对上述问题，本发明提供了油菜黑胫病菌Lbc特异性序列，该序列在油菜黑胫病菌中特异性存在，能对近缘种及亚种进行很好的区分；同时针对该序列，设计了油菜黑胫病菌Lbc的特异性LAMP检测引物，建立一种适用于田间的LAMP快速检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供了油菜黑胫病菌亚种L.biglobosa‘canadensis’的特异性序列在油菜黑胫病菌检测中的应用，所述的油菜黑胫病菌亚种的特异性序列为SEQ IDNO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了检测SEQ ID NO.1所示序列的试剂在制备油菜黑胫病菌检测试剂中的应用。

本发明的还有一个目的在于提供了针对SEQ ID NO.1所示序列设计的引物在制备油菜黑胫病菌检测试剂中的应用。

本发明还有一个目的在于提供了针对油菜黑胫病菌亚种的特异性序列设计的LAMP引物，所述的引物为：lbc181F3:5’-GGATCATTACCCTTCTATCAGAG-3’、lbc181B3:5’-GATCCGTTGTTGAAAGTTGT-3’、lbc181FIP:5’-ATGGGTAGAATCAGAAAGGAAAGGGATTGGTGTCAGGATTACG-3’、lbc181BIP:5’-TTGCGTACTATTTGTTTCCTTGGTACTGACGCTGACTGCAATT-3’。

为了达到以上目的，本发明采取以下技术措施：

目前，还没有Lbc的全基因组的公布报道，因此无法直接对菌株间的特异性序列进行比对。看家基因在亚种间的保守性很强，在设计特异性引物区分亚种时往往更倾向于选择其他的特异性序列；本发明突破性的发现了Lbc的ITS序列，可作为鉴定L.biglobosa‘canad ensis’的特异性序列，最终确定了SEQ ID NO.2所示序列为其鉴定靶标，该序列包含SEQ ID NO.1所示序列。

SEQ ID NO.1所示序列或SEQ ID NO.2所示序列在油菜黑胫病菌L.biglobosa‘canad ensis’(Lbc)检测中的应用，只要利用该序列用于L.biglobosa‘canadensis’的检测，都属于本发明的保护内容。

检测SEQ ID NO.1所示序列或SEQ ID NO.2所示序列的试剂在制备油菜黑胫病菌L.biglobosa‘canadensis’检测试剂中的应用，包括针对SEQ ID NO.1所示序列设计的引物在制备油菜黑胫病菌检测试剂中的应用，只要针对该序列设计的引物用于油菜黑胫病菌L.bi globosa‘canadensis’的检测，都属于本发明的保护内容。

以上所述的应用中，优选的，针对SEQ ID NO.1所示序列设计的LAMP引物，所述的引物为：lbc181F3:5’-GGATCATTACCCTTCTATCAGAG-3’、lbc181B3:5’-GATCCGTTGTTGAAAGTTGT-3’、lbc181FIP:5’-ATGGGTAGAATCAGAAAGGAAAGG-GATTGGTGTCAGGATTACG-3’、lbc181BIP:5’-TTGCGTACTATTTGTTTCCTTGGTA-CTGACGCTGACTGCAATT-3’；

针对SEQ ID NO.2所示序列设计的常规PCR引物为lbcF:5’-AGAGGATTGGTGTCAGGATTTCG-3’、lbcR:5’-GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG-3’。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明提供了L.biglobosa‘canadensis’的特异性检测靶标，在申请日之前，还从未有此相关报道。该靶标具备特异好、稳定性强和灵敏度高的特点，对于有着较高的同源性油菜黑胫病菌近缘种和亚种能很好的区分，避免了假阳性的产生。

2.针对L.biglobosa‘canadensis’的特异性序列设计了LAMP引物，由于LAMP引物的设计需要结合靶序列上的六个区域，可以精确检测到油菜黑胫病菌Lbc的存在，可以检测到988fg/μL的Lbc基因组DNA，而针对SEQ ID NO.2所示的序列，设计的常规的PCR引物(lbcF:5’-AGAGGATTGGTGTCAGGATTTCG-3’、lbcR:5’-GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG-3’)只能检测到98.8pg/μL。

3.本发明的提供的检测引物具有特异好、灵敏度高、稳定性强和快速简便的优点，在检测过程中很好地控制了假阳性的出现，同时又可以精确检测到L.biglobosa‘canadensis’的存在。这为油菜黑胫病菌Lbc的田间检测，以及该病害的田间监测鉴定等提供了很好的工具。

附图说明

图1为油菜黑胫病菌L.biglobosa‘canadensis’的LAMP检测引物特异性检测可视化图及凝胶电泳图；

其中上图：1-6管：6株采自春油菜产区的L.biglobosa‘canadensis’菌株(具体顺序见表1)，7-23管：17株亚种L.biglobosa‘brassicae’，24-25管：2株近缘种L.maculans，26-35管：10株在油菜上分离得到的病原真菌(依次是：Phoma sp.、Phoma macrostoma、Phoma sp.、Phoma glomerata、Phoma herbarum、Botrytis cinerea、Sclerotiniasclerotiorum、Colle totrichum sp.、Alternaria alternata、Chaetomiumglobosum)，第36管：阴性对照；

下图：凝胶电泳图：泳道M:100bp DNA Ladder，泳道1-3：3株L.biglobosa‘canadensis’菌株，泳道4-18：对应表1中的21-35号菌株，泳道19：阴性对照，水；

图2为油菜黑胫病菌L.biglobosa‘canadensis’LAMP检测引物灵敏度检测可视化图及凝胶电泳图；

上图为油菜黑胫病菌L.biglobosa‘canadensis’的检测可视化图，其中1-9管的油菜黑胫病菌L.biglobosa‘canadensis’，DNA浓度分别为：988ng/μL、98.8ng/μL,9.88ng/μL,988pg/μL,98.8pg/μL,9.88pg/μL,988fg/μL,98.8fg/μL,9.88fg/μL，第10管:阴性对照；

下图为油菜黑胫病菌L.biglobosa‘canadensis’的扩增产物凝胶电泳图，其中泳道M:100bp DNA Ladder，1-9：988ng/μL、98.8ng/μL,9.88ng/μL,988pg/μL,98.8pg/μL,9.88pg/μL,988fg/μL,98.8fg/μL,9.88fg/μL的油菜黑胫病菌L.biglobosa‘canadensis’的基因组DNA，10:阴性对照。

图3为油菜黑胫病菌L.biglobosa‘canadensis’特异性LAMP检测引物检测田间油菜茎秆可视化图及凝胶电泳图；

上图：1-4管：田间采集发病油菜茎秆DNA，5-12管:未显症状油菜茎秆DNA；

下图：泳道M:100bp DNA Ladder,1-4:田间采集发病油菜茎秆DNA，5-12:未显症状油菜茎秆DNA。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或材料，如未特别说明均为公众可获得的。

实施例1：

L.biglobosa‘canadensis’的特异性序列筛选及检测引物的开发：

Lbc和亚种Lbb的ITS同源性高达97.98％，并且Lbc的全基因组还未公布报道，因此无法直接对菌株间的特异性序列进行比对，通过对多个序列进行筛选，本发明突破性的发现了Lbc的ITS序列，可作为鉴定L.biglobosa‘canadensis’的特异性序列，最终确定了SEQID NO.2所示序列为其鉴定靶标，该序列包含SEQ ID NO.1所示序列。

针对SEQ ID NO.2所示的靶标序列，申请人进一步选择了SEQ ID NO.1所示序列作为LAMP检测的靶标序列，为了加强LAMP引物的特异性，申请人将引物的3’端设计在突变碱基处，据此设计了11组引物，只有3组引物呈现阴阳性的结果，进一步调整引物的第二位碱基，造成碱基错配从而降低扩增过程中非特异性扩增，优化结果，最终得到了本发明提供的引物组为检测Lbc的LAMP特异性引物组。

针对SEQ ID NO.2所示序列设计的检测油菜黑胫病菌(L.biglobosa‘canadensis’)的普通PCR引物为：

lbcF:5’-AGAGGATTGGTGTCAGGATTTCG-3’、lbcR:5’-GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG-3’。

针对SEQ ID NO.1所示序列设计的检测油菜黑胫病菌(L.biglobosa‘canadensis’)的LAMP引物为：

lbc181F3:5’-GGATCATTACCCTTCTATCAGAG-3’、

lbc181B3:5’-GATCCGTTGTTGAAAGTTGT-3’、

lbc181FIP:5’-ATGGGTAGAATCAGAAAGGAAAGGGATTGGTGTCAGGATTACG-3’、

lbc181BIP:5’-TTGCGTACTATTTGTTTCCTTGGTACTGACGCTGACTGCAATT-3’。

LAMP扩增体系如下：

Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase购买自New England Biolabs公司。

LAMP扩增程序如下：

65℃反应40min；80℃灭活5min

在反应产物中加入0.2μL 1000×SYBR Green I，阳性反应显示荧光绿色，表明有油菜黑胫病菌L.biglobosa‘canadensis’的存在；阴性对照保持橙色。

实施例2：

油菜黑胫病菌(L.biglobosa‘canadensis’)LAMP引物特异性检测及灵敏度检测：

油菜黑胫病菌(L.biglobosa‘canadensis’)LAMP引物特异性检测：

共选取了35个菌株样本，对本发明提供的引物进行特异性检测：

6株L.biglobosa‘canadensis’菌株；17株亚种L.biglobosa‘brassicae’；2株近缘种L.ma culans；10株在油菜上分离得到的病原真菌(依次是：Phoma sp.、Phomamacrostoma、Pho ma sp.、Phoma glomerata、Phoma herbarum、Botrytis cinerea、Sclerotinia sclerotiorum、C olletotrichum sp.、Alternaria alternata、Chaetomiumglobosum)，所有菌株如表1所示。

利用实施例1中涉及到的两种引物，即普通PCR引物和LAMP引物，对表1中所述菌株进行了检测，结果相同，具体结果如表1所示。

表1中“+”表示结果阳性，“-”表示结果阴性。

表1

油菜黑胫病LAMP引物灵敏性检测

将油菜黑胫病菌Lbc的基因组DNA进行10倍浓度梯度稀释，用本发明提供的两种引物检测其灵敏性。结果表明，LAMP引物可以检测到最低浓度为988fg/μL的油菜黑胫病菌DNA，灵敏性较强(图2)，普通PCR引物的最低检测浓度为98.8pg/μL。

实施例3：

油菜黑胫病菌L.biglobosa‘canadensis’的LAMP特异性检测引物的田间应用：

在内蒙古海拉尔市春油菜产区采集发病的油菜茎秆，从中随机选取4株油菜黑胫病明显发病的茎秆和8株未显症状的油菜茎秆，对发病组织提取DNA，用本发明提供的LAMP引物进行LAMP检测，结果显示，4株发病油菜茎秆上均检测到了油菜黑胫病菌Lbc的存在，而8株未显症状的油菜茎秆上检测到2株油菜茎秆也有油菜黑胫病菌Lbc的存在，只有6株未检测到该病菌的存在(图3)，将2株未显症状检测结果为阳性的油菜茎秆保湿培养于25℃的环境中，7天以后观察到有黑胫病典型的褐色病斑出现，表明此LAMP引物可以用于检测油菜病组织中的L.biglobosa‘canadensis’。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 油菜黑胫病菌加拿大亚种Lbc的特异性序列在油菜黑胫病菌检测中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agggatcatt acccttctat cagaggattg gtgtcaggat ttcggccttt ggcttacttt 60

ctggcccttt cctttctgat tctacccatg ttttttgcgt actatttgtt tccttggtag 120

gcttgcctgc caaaaggaca attcaaacca cttgtaattg cagtcagcgt cagtaacaat 180

gtaataatta caactttcaa caacggatct cttggttctg gcatcgatga agaacgcagc 240

<210> 2

<211> 586

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta cccttctatc aggggattgg tgtcagcagt 60

tgagcctttg gcttaatttc tgtccctttc ctttctgatt ctacccatgt tttttgcgta 120

ctatttgttt ccttggtggg cttgcctgcc aaaaggacaa ttcaaaccac ttgtaattgc 180

agtcagcgtc agtaacaatg taataattac aactttcaac aacggatctc ttggttctgg 240

catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtagtgtga attgcagaat tcagtgaatc 300

atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgcccct tggtattcca tggggcatgc ctgttcgagc 360

gtcatttgta ccctcaagct ctgcttggtg ttgggtgaat gttctctgtg cttgcgcaga 420

ctggactcgc ctgaaaacaa ttggcagccg gcatattggc ctggagcgca gcacattttg 480

cgcctcttgc tatgattgtt ggcatccatc aagatatttt attagctctt gacctcggat 540

caggtaggga tacccgctga acttaagcat atcaataagc ggagga 586

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agaggattgg tgtcaggatt tcg 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcaaaatgtg ctgcgctcca gg 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggatcattac ccttctatca gag 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatccgttgt tgaaagttgt 20

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgggtagaa tcagaaagga aagggattgg tgtcaggatt acg 43

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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