一种鼠尾草甲素及其制备方法以及包含鼠尾草甲素的药物

摘要

本发明公开了一种鼠尾草甲素及其制备方法以及包含鼠尾草甲素的药物，制备鼠尾草甲素时先将鼠尾草茎叶粉碎，并用氯仿/甲醇混合溶剂对粉碎物进行冷浸提取；然后浓缩提取液并用不同比例的石油醚/丙酮混合溶剂对浓缩后的浸膏进行梯度洗脱，收集石油醚：丙酮＝7:3的洗脱段组分；再用体积比为200:1的氯仿/丙酮混合溶剂对收集的组分进行硅胶柱层析；最后用体积比为1:1的氯仿/甲醇混合溶剂对经过硅胶柱层析处理的组分进行Sephadex LH‑20柱层析，得鼠尾草甲素。本发明所制得的鼠尾草甲素可以转化为药学上可接受的衍生物，丰富了药物种类，为疾病的治疗提供了更多的选择性。

说明书

技术领域

本发明属于药物制备技术领域，具体涉及一种鼠尾草甲素及其制备方法以及包含鼠尾草甲素的药物。

背景技术

癌症是一类严重威胁人们健康和生命的常见病和多发病，是造成人类死亡的第二大疾病，仅次于心脑血管疾病。受人口增长和老龄化等因素影响，中国癌症病例数量近年不断攀升，已成为世界癌症病例高发区。据国家癌症登记中心(National Central CancerRegistry of China,NCCR)统计，2015年我国全年癌症新增病例和死亡病例已分别达到429.2万和281.4万。

对肿瘤的治疗手段主要包括外科手术、放射疗法、化学疗法。近年随着纳米分子医学和分子生物学技术的突飞猛进，肿瘤发生机制的阐述、抗肿瘤靶点的寻找、新型抗肿瘤药物的开发以及治疗手段的创新和综合运用都有了长足的进步，肿瘤患者生存时间明显延长。但是，严重威胁人类生命健康的占恶性肿瘤90％以上的实体瘤的治疗尚未达到满意的疗效，仍有大量肿瘤患者因对治疗无反应或耐药而最终导致治疗失败。因此，发现并开发新型抗肿瘤药物仍然是人们所要持续面对的问题。最新研究统计，从1981年到2014年，全球批准上市的136个小分子抗肿瘤药物中有83％(113个)直接或间接来源于天然产物，这表明利用天然产物中的新颖结构来开发新的抗肿瘤药物具有很强的可行性。

唇形科(Labiatae)鼠尾草属(Salvia)植物约有1000余种，我国有84种，其中包括许多重要的药用植物，如丹参、红根草、甘西鼠尾草等。该属植物的化学成分主要为萜类和多酚类化合物，其中部分二萜类化合物具有显著的生物活性。如从丹参中的活性成分丹参酮ⅡA的磺酸钠盐已在临床上用于治疗心血管疾病；从红根草中分离得到的化合物saprothoquinone，经结构修饰，得到了一种抗肿瘤活性十分显著的TOPOⅡ抑制剂沙尔威辛(salvicine)。

迄今，现有技术中未见本发明所涉及的二萜类化合物椴叶鼠尾草甲素及其作为有效成分在治疗和预防肿瘤方面的报道，以及该化合物具有抗肿瘤活性的报道。

发明内容

本发明通过全新的提取技术，可以从椴叶鼠尾草中提取一种二萜类化合物，该化合物具有如下结构：

本发明根据化合物常见的命名方法将制得的化合物命名为鼠尾草甲素，鼠尾草甲素的制备方法包括以下步骤：

S1：将干燥的鼠尾草茎叶粉碎，在室温下用氯仿/甲醇混合溶剂对粉碎物提取3～5次，合并提取液并浓缩至体积不再变化，得浸膏；氯仿/甲醇混合溶剂中氯仿与甲醇的体积比为1:2～2:1；

S2：依次用体积比为9:1、8:2、7:3、6:4、1:1的石油醚/丙酮混合溶剂对S1所得浸膏进行梯度洗脱得到5个组分，收集其中的第3个组分；

S3：用体积比为200:1的氯仿/丙酮混合溶剂对S2收集的组分进行硅胶柱层析，总共进行2～4次；

S4：用体积比为1:1的氯仿/甲醇混合溶剂对经过S3处理的组分进行Sephadex LH-20柱层析，总共进行2～4次，浓缩层析液，得鼠尾草甲素。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，S1中将鼠尾草茎叶粉碎至40～60目。

进一步，氯仿/甲醇混合溶剂中氯仿与甲醇的体积比为1:1。

本发明所制得的鼠尾草甲素可以转化为药学上可接受的衍生物，如双键可以还原、氧化或卤化；可通过酯水解反应脱去乙酰基，然后可继续对羟基进行氧化或酰化(如引入苯甲酰基、琥珀酰基、肉桂酰基、阿魏酰基)，通过一系列化学反应，可以在本发明中化合物上接枝各种基团，为新药的制备提供了更多的可能。

本发明中的化合物用作药物上时，可以直接使用，也可以以药物组合物的形式使用。以药物组合物使用时，药物组合物中含有质量分数为0.1～99％的鼠尾草甲素，为保证最优治疗效果，鼠尾草甲素的含量优选为0.5～90wt％，其余为对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

药物组合物中的药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂，如乳糖、淀粉、硬脂酸镁、氯化钠溶液等。将药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经口服和注射(静注、肌注)两种形式给药，其中口服可用其固体或液体制剂，如粉剂、片剂、糖衣剂、胶囊、溶液、糖浆、滴丸剂等，注射可用其固体或液体制剂，如粉针剂、溶液形注射剂等。

具体实施方式

本发明通过一种新的提取方法，从椴叶鼠尾草中提取出一种新的二萜类化合物，该化合物具有如下结构：

本发明根据化合物常见的命名方法将制得的化合物命名为鼠尾草甲素，鼠尾草甲素的制备方法包括以下步骤：

S1：用粉碎机将含水量在10％以下的椴叶鼠尾草茎叶粉碎，粉碎物过40～60目筛，取筛下物并在室温下用氯仿/甲醇混合溶剂对其回流提取3～5次，合并提取液，然后采用减压浓缩等方式将提取液浓缩至体积不再变化，得浸膏；回流提取过程中所用的氯仿/甲醇混合溶剂中氯仿与甲醇的体积比为1:2～2:1；

S2：用正相硅胶对S1中所得浸膏进行分离，分离时依次用体积比为9:1、8:2、7:3、6:4、1:1的石油醚/丙酮混合溶剂对浸膏进行梯度洗脱，得到5个组分，收集其中的第3个组分(油醚：丙酮＝7:3的洗脱组分)；

S3：用体积比为200:1的氯仿/丙酮混合溶剂对S2收集的第3个组分进行硅胶柱层析，柱层析总共进行2～4次，收集柱层析后的组分；

S4：用体积比为1:1的氯仿/甲醇混合溶剂对经过硅胶柱层析处理的组分进行Sephadex LH-20柱层析，总共进行2～4次，收集层析液并浓缩，得鼠尾草甲素。

下面结合实施例对本发明的具体制备方法做详细的说明。

实施例一

一种鼠尾草甲素的制备方法，包括以下步骤：

S1：将9kg干燥的椴叶鼠尾草茎叶粉碎，在室温下用氯仿/甲醇混合溶剂对粉碎物提取3次，合并提取液并减压浓缩至体积不再变化，得360g浸膏；其中，氯仿/甲醇混合溶剂中氯仿与甲醇的体积比为1:1；

S2：依次用体积比为9:1、8:2、7:3、6:4、1:1的石油醚/丙酮混合溶剂对S1所得浸膏进行梯度洗脱得到5个组分，收集其中的第3个组分；

S3：用体积比为200:1的氯仿/丙酮混合溶剂对S2收集的组分进行硅胶柱层析，总共进行3次；

S4：用体积比为1:1的氯仿/甲醇混合溶剂对经过S3处理的组分进行Sephadex LH-20柱层析，总共进行3次，减压浓缩层析液，得200mg鼠尾草甲素。

实施例二

一种鼠尾草甲素的制备方法，包括以下步骤：

S1：将9kg干燥的鼠尾草茎叶粉碎，在室温下用氯仿/甲醇混合溶剂对粉碎物提取4次，合并提取液并减压浓缩至体积不再变化，得370g浸膏；其中，氯仿/甲醇混合溶剂中氯仿与甲醇的体积比为1:2；

S2：依次用体积比为9:1、8:2、7:3、6:4、1:1的石油醚/丙酮混合溶剂对S1所得浸膏进行梯度洗脱得到5个组分，收集其中的第3个组分；

S3：用体积比为200:1的氯仿/丙酮混合溶剂对S2收集的组分进行硅胶柱层析，总共进行4次；

S4：用体积比为1:1的氯仿/甲醇混合溶剂对经过S3处理的组分进行Sephadex LH-20柱层析，总共进行2次，减压浓缩层析液，得205mg鼠尾草甲素。

实施例三

一种鼠尾草甲素的制备方法，包括以下步骤：

S1：将9kg干燥的鼠尾草茎叶粉碎，在室温下用氯仿/甲醇混合溶剂对粉碎物提取5次，合并提取液并减压浓缩至体积不再变化，得375g浸膏；其中，氯仿/甲醇混合溶剂中氯仿与甲醇的体积比为2:1；

S2：依次用体积比为9:1、8:2、7:3、6:4、1:1的石油醚/丙酮混合溶剂对S1所得浸膏进行梯度洗脱得到5个组分，收集其中的第3个组分；

S3：用体积比为200:1的氯仿/丙酮混合溶剂对S2收集的组分进行硅胶柱层析，总共进行2次；

S4：用体积比为1:1的氯仿/甲醇混合溶剂对经过S3处理的组分进行Sephadex LH-20柱层析，总共进行4次，减压浓缩层析液，得205mg鼠尾草甲素。

结果分析

取实施例一中的白色粉末成品进行质谱分析，分析结果如下：

分子式C₂₂H₂₂O₇；ESIMS(pos.)：m/z>+；HRESIMS：m/z>+(421.1263calcd>22H₂₂O₇Na)；(c 0.20,MeOH)；UV(MeOH)λ_max:219,270(sh)nm；IR(KBr)ν_max：2924，2868，1757，1739，1693，1642，1509，1307，1234，1160，1094，1006，949cm^-1；同时进行了核磁共振分析，共振波谱数据见表2。

表2.NMR Spectroscopic Data in CDCl₃

结合质谱分析和核磁共振分析结果，可以得知本发明所制备出的鼠尾草甲素具有如下结构：

另外，本发明还将制得化合物制成了可使用的药物，根据用药习惯不同，可以将鼠尾草甲素制成粉剂、片剂、糖衣剂、胶囊、溶液、糖浆或滴丸剂等。其中，

1.片剂包括：鼠尾草甲素10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸镁5mg；

制备方法：将化合物、乳糖、淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，其中化合物含量10mg。

2.胶囊剂包括：鼠尾草甲素100mg，淀粉100mg，硬脂酸镁适量；

制备方法：将化合物与助剂混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，将所得混合物装入硬明胶胶囊。

3.安瓿剂包括：鼠尾草甲素2mg，氯化钠10mg；

制备方法：将化合物和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤，所得溶液在无菌条件下装入安瓿瓶中。

为考察所制得的化合物对肿瘤具有防治效果，本发明用MTT法进行铣刨活性检测。MTT全称为3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色(或蓝紫色)不溶于水的甲臜(formazan)，甲臜的含量可以用酶标仪在570nm处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。

实验方法：

1.接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液(DMEM或者RMPI1640)配成单个细胞悬液，以每孔10000-20000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl，贴壁细胞提前12小时接种培养。

2.加入本发明所制备的化合物的溶液(固定浓度40μM初筛，在该浓度对肿瘤细胞生长抑制在50％附近的化合物设5个浓度进入梯度复筛)，每孔终体积200μl，每种处理均设3个复孔。

3.显色：37℃培养48小时后，每孔加MTT溶液20μl。继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液100μl以避免细胞丢失，每孔加20％的SDS100μl，过夜孵育(温度37℃)，使结晶物充分融解。

4.比色：选择595nm波长，酶联免疫检测仪(Bio-Rad 680)读取各孔光吸收值，记录结果，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed andMuench法)计算化合物的IC₅₀值。

实验结果见表1。

表1椴叶鼠尾草甲素对肿瘤细胞株的半数生长抑制浓度IC₅₀(μM)

从表中可以看出，椴叶鼠尾草甲素具有明显的体外肿瘤细胞毒活性。

虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。