用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料及其制备方法与应用，该磁性纳米复合材料由Fe

说明书

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，涉及能够同时富集多种模式肽段的磁性纳米复合材料及其制备方法与应用。

背景技术

磁性金属-有机骨架纳米复合材料是由磁性纳米球及包裹在磁性纳米球表面的金属-有机骨架(Metal-Organic Frameworks,MOFs)构成，在具有良好磁响应性能的同时，兼具了MOFs的孔隙率高、机械性能优良、芳香配体丰富以及表面性能易于调整等独特性质，因此，近年来磁性金属-有机骨架纳米球备受关注，已经被广泛应用于生物医学领域，尤其是蛋白或多肽分离、药物传递、磁共振成像等方面。

目前磁性金属-有机骨架纳米复合材料对于磷酸化多肽和糖肽的富集应用都是单模式的，即只能用于一种肽段(磷酸化多肽或者糖肽)的富集。Weibing Zhang等公开了一种磁性金属-有机骨架纳米球的制备方法，并给出了该磁性金属-有机骨架纳米球在磷酸化多肽富集方面的应用，该磁性金属-有机骨架纳米球以Fe³⁺作为金属离子，三甲基苯作为有机配体，首先用甲基丙烯酸甲酯(Methyl>3+的溶液和三甲基苯溶液中搅拌反应，完成一次自组装，如此重复31次，即获得磁性金属-有机骨架纳米球，该磁性金属-有机骨架纳米球只能用于对磷酸化多肽的富集(Facile>2+作为金属离子，2-甲基咪唑为有机配体，常温下超声得到磁性金属-有机骨架复合材料，该磁性金属-有机骨架复合材料只对于糖肽有较好的富集应用(Development>

然而，经研究表明异常的蛋白磷酸化和蛋白糖基化都与癌症有一定的联系，因此研发出能富集磷酸化肽段和糖肽段的磁性吸附材料，对于癌症疾病的诊断治疗将有着重大的意义。

发明内容

本发明的目的旨在针对上述现有技术中存在的问题，提供一种用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料及其制备方法，以便能实现磷酸化多肽和糖肽两种肽段的富集。

本发明另一目的旨在提供上述用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料在富集磷酸化多肽和糖肽方面的应用。

本发明所述用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料，由Fe₃O₄磁球、包覆于Fe₃O₄磁球表面的SiO₂层、生长于SiO₂层上的金属-有机框架层构成；所述金属-有机框架层是由金属离子Zr⁴⁺与两种有机配体通过配位作用形成，两种有机配体为对苯二甲酸和对苯二硼酸。

本发明所述用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料，呈现完整的球形，粒径均匀且分布较窄，平均粒径为350～450nm左右，这种形状规整、尺寸均匀的纳米粒子比较适合用于蛋白多肽的富集与分离应用。该磁性纳米复合材料以超顺磁性四氧化三铁(Fe₃O₄磁球)作为内核，具有高的磁饱和强度，从而对外加磁场具有很好的磁响应性能；本发明采用的Fe₃O₄磁球占磁性纳米复合材料质量的60％左右，从而使磁性纳米复合材料的饱和磁化强度达到36emu>-1左右。包覆于Fe₃O₄磁球表面的SiO₂层作为中间层，可以螯合Zr⁴⁺金属离子从而有利于金属-有机框架的原位生长。Fe₃O₄磁球表面包覆的SiO₂具有很好的分散性，可以解决传统金属-有机框架材料中以聚多巴胺(PDA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为中间层容易导致材料团聚的问题。本发明合成金属-有机骨架的原料选用Zr⁴⁺作为金属离子，一方面其为合成金属-有机骨架的组分之一，同时作为富集磷酸化多肽的一种亲和位点。本发明以对苯二甲酸和对苯二硼酸作为有机双配体，一方面其为合成金属-有机骨架的组分之一，另一方面对苯二硼酸上的硼酸基团可以作为富集糖肽的一种亲和位点。

本发明所述用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料的制备方法，主要是通过外延生长的机理来实现，首先采用溶胶凝胶法在Fe₃O₄磁球表面包裹一层SiO₂，再以氯化锆(ZrCl₄)、对苯二甲酸和对苯二硼酸为原料采用一锅法在SiO₂层表面生成金属-有机框架层。

本发明所述用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料的制备方法，步骤如下：

(1)制备Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子

在超声条件下，向均匀分散有Fe₃O₄磁球的悬浮液中依次加入氨水和硅烷偶联剂，经超声分散均匀后搅拌反应2～6h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，所得固体产物依次用乙醇、去离子水、二甲基甲酰胺洗涤即得到Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子(即SiO₂层包覆Fe₃O₄磁球的纳米粒子)；所述均匀分散有Fe₃O₄磁球的悬浮液是将Fe₃O₄磁球均匀分散于由乙醇和去离子水组成的混合液中得到；所述Fe₃O₄磁球、氨水和硅烷偶联剂的质量体积比为100：(0.5～2)：(0.5～2)，质量体积比的质量以mg计，体积以mL计；

(2)制备Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料

在搅拌条件下，将均匀分散有Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子的悬浮液及ZrCl₄溶液、对苯二甲酸溶液、对苯二硼酸溶液依次加入到110～140℃的二甲基甲酰胺中形成反应体系，继续搅拌反应2～6h；之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，所得固体产物依次用二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水洗涤并经干燥后即得到Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料(即在Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子表面生长有金属-有机框架层的磁性纳米复合材料)；所述反应体系中Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子与ZrCl₄的质量比为1:(1～3)；所述Zr⁴⁺与对苯二甲酸和对苯二硼酸的摩尔比为1:1；所述对苯二甲酸与对苯二硼酸的摩尔比为(2～1):(1～2)。

上述用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料的制备方法，所述Fe₃O₄磁球主要是以氯化铁、醋酸铵、柠檬酸钠为原料，以乙二醇为溶剂的水热法合成粒径大概在200nm～300nm的超顺磁性四氧化三铁纳米球；此外通过调节水热反应时间可调控磁球粒径分布。制备Fe₃O₄磁球的具体实现方式可以参考现有技术中已经披露的常规制备方法得到，参见Thedesign>4+-immobilized>

上述用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料的制备方法，步骤(1)中，所采用的Fe₃O₄磁球需要进行预处理，在对Fe₃O₄磁球清洗的同时，激活磁球表面羧基和羟基等基团。预处理过程为：首先将Fe₃O₄磁球放入盐酸(盐酸浓度为0.1M)中超声处理10～60min，之后对超声所得产物进行磁分离并收集分离出的固体产物，所得固体产物经去离子水洗涤即可。

上述用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料的制备方法，步骤(1)中，用于制备Fe₃O₄磁球悬浮液的混合液中乙醇与去离子水的体积比为4:1。

上述用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料的制备方法，步骤(2)中，所述均匀分散有Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子的悬浮液是将Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子均匀分散于二甲基甲酰胺中得到；ZrCl₄溶液、对苯二甲酸溶液、对苯二硼酸溶液是将氯化锆、对苯二甲酸、对苯二硼酸分别溶解于二甲基甲酰胺中得到。通过调整Zr⁴⁺、对苯二甲酸、对苯二硼酸的比例及反应时间，可以实现对金属-有机框架材料结构的调控，上述Zr⁴⁺与对苯二甲酸和对苯二硼酸组成的有机配体的摩尔比为1:1时，有利于金属-有机骨架的形成；调控对苯二甲酸和对苯二硼酸的比例为1:1时，有利于引入更多的硼酸基团。

上述用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料的制备方法，步骤(1)和步骤(2)洗涤的目的均是为了除去吸附在固体产物表面未反应的物料，一般每种洗液洗涤3～5遍即可。所述步骤(1)中用与步骤(2)中作为反应环境相同的二甲基甲酰胺进行洗涤，以免引入其它杂溶剂，不利于后续反应。

上述用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料的制备方法，采用的搅拌操作为常规的机械搅拌。步骤(1)中，溶胶凝胶法制备Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子过程中搅拌速率为500～600rpm。步骤(2)中，一锅法制备Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料过程中搅拌速率为700～800rpm。

本发明所述磁性纳米复合材料在磷酸化多肽和糖肽富集中的应用，其对于生物样本中的磷酸化多肽和糖肽同样具有很好的富集效果，在研究生理行为蛋白磷酸化和糖基化过程中具有很重要的意义。

本发明所述磁性纳米复合材料富集磷酸化多肽和糖肽的操作为：

(1)富集磷酸化多肽：首先将磷酸化蛋白β-酪蛋白用胰蛋白酶消化成磷酸化多肽，并用缓冲液进行稀释，然后加入本发明所述磁性纳米复合材料混合搅拌，在室温下利用摇床摇动10～60min使磷酸化多肽都富集在磁性纳米复合材料表面，然后再外加磁场的作用下利用磁分离将表面吸附了磷酸化多肽的磁性纳米复合材料从溶液中分离出来，再将表面吸附了磷酸化多肽的磁性纳米复合材料加入到解吸附液中将磷酸化多肽从磁性纳米复合材料上解吸附下来。其中吸附磷酸化多肽的是磁性纳米复合材料表面的金属-有机骨架，其中金属离子Zr⁴⁺利用固定金属离子亲和色谱层析法(IMAC)原理实现对磷酸化多肽的富集。通过增加缓冲溶液的pH实现了被吸附磷酸化多肽从磁性纳米复合材料表面脱离，从而实现了磷酸化多肽的富集和分离。

(2)富集糖肽：首先将糖基化蛋白免疫球蛋白G用胰蛋白酶消化成糖肽，并用缓冲液进行稀释，然后加入本发明所述磁性纳米复合材料混合搅拌，在室温下利用摇床摇动10～60min使糖肽都富集在磁性纳米复合材料表面，然后再外加磁场的作用下利用磁分离将表面吸附了糖肽的磁性纳米复合材料从溶液中分离出来，再将表面吸附了糖肽的磁性纳米复合材料加入到解吸附液中将糖肽从磁性纳米复合材料上解吸附下来。其中吸附糖肽的是磁性纳米复合材料表面的金属-有机骨架，其中有机配体对苯二硼酸上的硼酸基团利用苯硼酸的亲和色谱层析法原理实现对糖肽的富集。通过改变缓冲液的组分实现了被吸附磷酸化多肽从磁性纳米复合材料表面脱离，从而实现了糖肽的富集和分离。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料，以Fe₃O₄磁球作为内核，具有很好的磁响应性能；在Fe₃O₄磁球表面引入由Zr⁴⁺及对苯二甲酸、对苯二硼酸组成的金属-有机骨架，以Zr⁴⁺作为磷酸化多肽的亲和位点，对苯二甲酸有利于金属-有机框架的构建，对苯二硼酸一方面可以参与金属-有机框架的构建，另一方面其上的硼酸基团作为糖肽的亲和位点，从而既能实现对于磷酸化多肽的富集，又能实现对糖肽的富集，且具有很高富集效率，在研究生理行为蛋白磷酸化和糖基化过程中具有十分重要的意义，且应用前景良好。

2、本发明提供的用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料，在Fe₃O₄磁球表面引入金属-有机骨架，其有机无机杂化的网络结构使得纳米球具有极好的稳定性，有利于纳米球不容易降解或者坍塌，可以长时间保持其形貌，便于磁性纳米复合材料的推广应用。

3、本发明提供的用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料的制备方法，首先采用溶胶凝胶法在Fe₃O₄磁球表面包裹上SiO₂层，然后采用一锅法通过外延生长方式生成一层金属-有机骨架，整个过程操作简单、反应条件温和，并且可在短时间内制备得到磁性纳米复合材料，因此易于在生物医药领域内推广。

附图说明

图1为本发明所述用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料的结构表征及其制备方法流程图。

图2为本发明实施例制备的磁性纳米材料形貌表征图，其中A为实施例3制备的Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子的扫描电镜(SEM)图，B为实施例16制备的Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料的扫描电镜(SEM)图，C为实施例3制备的Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子的透射电镜(TEM)图，D为实施例16制备的Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料的透射电镜(TEM)图。

图3为本发明实施例16制备的Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料的元素组成表征图。

图4为本发明实施例制备的磁性纳米材料的X射线衍射图谱，其中a对应实施例1制备的Fe₃O₄磁球，b对应实施例3制备的Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子，c对应实施例16制备的Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料。

图5为本发明实施例16制备的Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料的氮气吸附-解吸附曲线。

图6为本发明实施例制备的磁性纳米材料在-18000Oe到18000Oe范围内的磁滞回线图谱，其中a对应实施例1制备的Fe₃O₄磁球，b对应实施例3制备的Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子，c对应实施例16制备的Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料。

图7为本发明所述磁性纳米复合材料对磷酸化多肽和糖肽的富集与分离过程示意图。

图8为本发明应用例1中β-酪蛋白消化液的MS图谱，其中(a)为未经富集处理的β-酪蛋白消化液的MS图谱，(b)为经实施例16制备的Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料富集处理的β-酪蛋白消化液的MS图谱。

图9为本发明应用例2中免疫球蛋白G消化液的MS图谱，其中(a)为未经富集处理的免疫球蛋白G消化液的MS图谱，(b)为经实施例16制备的Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料富集处理的免疫球蛋白G消化液的MS图。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。

本发明提出的用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料结构，如图1C所示，该磁性纳米复合材料由Fe₃O₄磁球，包覆于Fe₃O₄磁球表面的SiO₂中间层、原位生长于SiO₂中间层上的金属-有机框架构成。本发明是基于图1给出的工艺流程制备该磁性纳米复合材料的，首先利用水热法制备Fe₃O₄纳米磁球(SPIOs)，如图1A所示；再依据溶胶凝胶法在制得的Fe₃O₄磁球表面包覆一层SiO₂中间层，得到SiO₂中间层包覆Fe₃O₄的磁性纳米粒子(SPIOs@SiO₂)，如图1B所示；最后将金属离子Zr⁴⁺、有机配体(由对苯二甲酸和对苯二硼酸组成)与Fe₃O₄/SiO₂磁性纳米粒子一起通过一锅法制备得到Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料(SPIOs@SiO₂/MOF)。

为使本发明提供的技术方案更加清楚，下面结合实施例给出更加详细的说明和解释。

实施例1 水热法制备超顺磁性Fe₃O₄纳米磁球

以下实施例中采用的Fe₃O₄磁球的具体制备过程为：将原料1.157gFeCl₃·6H₂O、3.303gNH₄Ac(醋酸铵)和0.4gNa₃CT(柠檬酸钠)加入到盛有60mL乙二醇的反应釜中，磁力搅拌1h使上述原料混合均匀；然后移除搅拌子，将反应釜升温至200℃，反应16小时；再将反应釜冷却至室温，对反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物；然后依次用乙醇、去离子水对固体产物进行洗涤(每种洗液洗涤五遍)，即得到Fe₃O₄磁球。

通过该方法得到的Fe₃O₄磁球能够均匀分散在水中，形成稳定的超顺磁性纳米颗粒悬浮液。对得到的Fe₃O₄磁球进行DLS(Dynamic>3O₄磁球粒径在300nm左右。

通过调节水热反应时间12～16h，可以调节得到的Fe₃O₄磁球粒径在200～300nm之间。

实施例2-实施例10Fe₃O₄磁球包裹二氧化硅(SiO₂)层(选用300nm的Fe₃O₄磁球)

按照表1称取原料，并结合表1中给出的工艺参数依据下述方法制备Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子：

(1)将20mL浓度为0.1M的HCl加入到盛有100mg Fe₃O₄磁球的100mL二口瓶中，超声处理30min后进行磁分离，并收集分离出的Fe₃O₄磁球，分离出的Fe₃O₄磁球用去离子水清洗三遍即完成对Fe₃O₄磁球的预处理。

(2)将预处理后的Fe₃O₄磁球加入到由乙醇和去离子水按体积比4:1组成的混合液中，得到Fe₃O₄磁球悬浮液，之后在超声条件下向Fe₃O₄磁球悬浮液中依次加入0.5～2mL氨水和0.5～2mL硅烷偶联剂(Tetraethylorthosilane，TEOS,Sigma)，超声分散30min得到分散均匀的混合液，所得混合液在机械搅拌下(500～600rpm)反应2～6h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，所得固体产物依次用乙醇、去离子水、二甲基甲酰胺(DMF)洗涤(每种洗液洗涤三次)，即得到Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子。对得到的Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子进行DLS(Dynamic>3O₄/SiO₂纳米粒子粒径在320～420nm左右，见表1所示。

表1 制备Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子的原料及其配比和工艺参数

从表1中可以看出，通过调控氨水与硅烷偶联剂的用量及反应时间，可以调整包裹在Fe₃O₄磁球表面的SiO₂中间层的厚度。从SiO₂中间层包覆牢固性、尺寸大小及节约药品等因素考虑，现选择350nm厚的Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子用于以下实施例Fe₃O₄/SiO₂/MOFs磁性纳米复合材料的制备。

实施例11-实施例18制备Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料

以下实施例采用的是一锅法，用到的反应装置为油浴加热、机械搅拌的二口瓶反应容器。

将116mg Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子均匀分散到2mL>3O₄/SiO₂纳米粒子悬浮液，将116～348mg氯化锆溶解于4mLDMF中得到氯化锆溶液，将对苯二甲酸溶解于4mLDMF中得到对苯二甲酸溶液，将对苯二硼酸溶解于4mLDMF中得到对苯二硼酸溶液。氯化锆溶液中Zr⁴⁺的物质的量与对苯二甲酸溶液和对苯二硼酸溶液中的对苯二甲酸和对苯二硼酸物质的量总和之比为1:1；对苯二甲酸(PTA)与对苯二硼酸(PBA)的摩尔比为(2～1):(1～2)。

结合表2中给出的工艺参数依据下述方法制备Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料：在机械搅拌条件下，向反应容器中加入30mL>3O₄/SiO₂纳米粒子悬浮液、氯化锆溶液、对苯二甲酸溶液、对苯二硼酸溶液，之后在110～140℃继续搅拌反应2～6h；反应结束后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，所得固体产物依次用DMF、乙醇和去离子水洗涤(每种洗液洗涤三遍)，洗涤所得产物经真空干燥，即得到Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料。对得到的Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料进行DLS(Dynamic>3O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料粒径在350～780nm左右，见表1所示。

表2 制备Fe₃O₄/SiO₂/MOFs磁性纳米复合材料的原料及其配比和工艺参数

从表2中可以看出，通过调控氯化锆、对苯二甲酸、对苯二硼酸及反应时间，可以调整生长在Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子SiO₂中间层上的金属有机框架厚度。且通过分析可以看出，在PTA量较少的情况下，不利于金属-有机框架的构成，所得到的纳米粒子尺寸基本不变，随着PTA量增多，金属-有机框架大量合成，但是考虑到PBA含量太少时，会影响对糖肽的富集，因此综合考虑，PTA与PBA的优选摩尔比为1:1。此外，当反应时间过长(如上述6h)，得到的纳米粒子粒径达780nm，表面所制备的金属-有机框架相互连接，导致纳米粒子团聚不分散，粒径变大，十分不利于对蛋白或肽段的富集应用。

结构表征

为了探究SiO₂中间层以及金属-有机骨架是否成功复合到Fe₃O₄纳米磁球上，对实施例1制备的Fe₃O₄磁球、实施例3制备的Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子、实施例16制备的Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料的形貌尺寸和微观结构进行了表征，如图2至图4所示。

对实施例3制备的Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子和实施例16制备的Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料采用扫描电镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)进行形貌分析，结果如图2所示；从图2可以看出，制备的Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子以及Fe₃O₄/SiO₂/MOFs磁性纳米复合材料均成大小均一、形貌规整的球形；此外，从图2C看出，纳米粒子表面十分光滑，且有一层晕，表明SiO₂中间层已经成功包裹在Fe₃O₄磁球表面，而图2D中，纳米粒子表面呈现粗糙的网络结构，这证明金属-有机骨架成功地合成到了Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子表面。

对实施例16制备的Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料进行X射线能谱分析(EDX)，分析结果如图3所示。从图3中可以，Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料中，C元素原子百分比为34.04％、N元素原子百分比为4.02％、O元素原子百分比为44.02％、B元素原子百分比为2.89％，Si元素原子百分比为4.64％，Fe原子百分比为5.79％，Zr元素原子百分比4.6％。从上述检测结果可以看出，Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料中存在Si、Zr、B元素，进一步证明SiO₂中间层和MOFs层(MOFs层中的金属离子为Zr⁴⁺，有机配体PBA含有B元素)已经成功在Fe₃O₄磁球表面形成，高含量的Zr⁴⁺有利于对于磷酸化多肽的富集应用，高含量的B有利于对于糖肽的富集应用。

对实施例1制备的Fe₃O₄磁球、实施例3制备的Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子和实施例16制备的Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料进行X射线衍射分析，分析结果如图4所示。从图4中可以看出，三种材料均具有与标准Fe₃O₄衍射峰一致的特征峰，说明Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料保留了Fe₃O₄磁球的晶体结构；同时Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料在(7.4°,8.4°,and>

对实施例16制备的Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料进行N₂吸附/解吸附测试，测试结果如图5所示。从图5中可以看出，所得N₂吸附/解吸附等温曲线表明此磁性金属-有机骨架纳米复合材料具有较大的比表面积和孔隙率，说明金属-有机骨架成功合成在了磁球表面，有利于对于肽段的富集应用。

综上所述，Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料的壳层具有金属-有机框架结构，且该结构并没有明显影响复合纳米材料的磁晶体结构，这种独特的MOF壳层将有利于在磷酸化多肽和糖蛋白捕获和分离中的应用。

磁性能测试

对实施例1制备的Fe₃O₄磁球、实施例3制备的Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子、实施例16制备的Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料采用Model>3O₄磁球、Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子、Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料都具有超顺磁性，其中Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料的饱和磁化强度达到36emu>-1左右。

应用例

本发明进一步提供了上述Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料在富集磷酸化多肽和糖肽方面的应用，Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料对于磷酸化多肽和糖肽的富集与分离过程，如图7所示，首先将Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料加入到待处理的样本中，然后在摇床中进行富集，时间可以根据样本多少进行调整，富集过程结束后通过磁分离方式将固体产物分离出来，之后再用解吸附的缓冲液对表面吸附有磷酸化多肽或糖肽的磁球进行解吸附，从而得到含有磷酸化多肽或糖肽的缓冲液。可以对得到的含有磷酸化多肽或糖肽的缓冲液进行MS(Mass>3O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料对磷酸化多肽或糖肽的富集效果。

应用例1 β-酪蛋白消化液中磷酸化多肽的富集

取1mgβ-酪蛋白溶解在1ml 50Mm pH为8.2的NH₄HCO₃缓冲液里，再加入25μg的胰蛋白酶，37℃条件下消化16h；然后用第一缓冲液(体积浓度为50％的乙腈水溶液,其中含有0.25％的三氟乙酸，即50％ACN-H₂O，0.25％TFA)稀释到10^-6M的浓度得到β-酪蛋白消化液。取1mg实施例16制备的Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料加入到200μlβ-酪蛋白消化液样本中，然后在摇床150-200rpm条件下于室温富集45min；之后用第一缓冲液清洗3遍(每次400μl)把非特异性吸附的多肽从磁性纳米复合材料表面除去；最后将吸附了磷酸化多肽的磁性纳米复合材料加入到10μl第二缓冲液(体积浓度为10％的氨水溶液)中，在摇床800-1200rpm剧烈摇动状态下解吸附30min，利用磁分离分离出磁性纳米复合材料，得到解吸附液。然后取1μl解吸附液和1μl未经富集处理的β-酪蛋白消化液进行质谱分析，分析结果如图8所示。

从图8可以看出，未经富集处理的β-酪蛋白消化液，用质谱检测只得到一条磷酸化多肽的信号，且信号很低【见图8(a)】；用Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料富集后，整个质谱图上都是磷酸化多肽的信号峰【见图8(b)，β_1s、β_2s为两个不同位置的单磷酸化位点的磷酸化多肽的特征峰,β_3m为多磷酸化位点的磷酸化多肽的特征峰】。上述分析结果看出，可以检测出所有的磷酸化多肽，而且强度高且没有杂肽，表明本发明所述的Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料能很好的富集磷酸化多肽，同时具有很好的选择性和很高的效率。

应用例2 糖基化蛋白免疫球蛋白G消化液中糖肽的富集

取2mg免疫球蛋白G溶解在1ml 50Mm pH为8.2的NH₄HCO₃缓冲液里，再加入50μg的胰蛋白酶，37℃条件下消化16h；然后用第一缓冲液(100mM>4HCO₃水溶液)稀释到10^-7M的浓度得到免疫球蛋白G消化液。取1mg实施例16制备的Fe₃O₄/SiO₂/MOFs磁性纳米复合材料加入到100μl免疫球蛋白G消化液样本中，然后在摇床150-200rpm条件下于室温富集45min；之后用第一缓冲液清洗3遍(每次400μl)把非特异性吸附的多肽从磁性纳米复合材料表面除去；最后将吸附了糖肽的磁性纳米复合材料加入到10μl第二缓冲液(体积浓度为50％的乙腈水溶液，其中含有体积浓度为1％的三氟乙酸，即50％ACN-H₂O包含1％TFA)中，在摇床800-1200rpm剧烈摇动状态下解吸附30min，利用磁分离分离出磁性纳米复合材料，得到解吸附液。然后取1μl解吸附液和1μl未经富集处理的免疫球蛋白G消化液进行质谱分析，分析结果如图9所示。

从图9可以看出，未经富集处理的免疫球蛋白G消化液，用质谱检只得到三条糖肽的信号，而且信号很低，整个MS图基本都是杂肽段的信号【见图9(a)】；用Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料富集后，整个质谱图上可以检测到25条糖肽的信号，而且整个MS图都是糖肽的信号峰【见图9(b)，I标记的都为糖肽的特征峰】。上述分析结果表明本发明所述的Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料能很好的富集糖肽，同时具有很好的选择性和很高的效率。

综上所述，本发明所述的Fe₃O₄/SiO₂/MOF磁性纳米复合材料可以实现多模式肽段的富集。