一种治疗神经母细胞瘤和神经胶质瘤的药物组合物及其用途

摘要

本发明涉及一种治疗神经母细胞瘤和神经胶质瘤的药物组合物，所述组合物包含他汀与醋酸阿比特龙或其盐，优选为辛伐他汀或氟伐他汀与醋酸阿比特龙组成的组合物。本发明的药物组合在治疗神经母细胞瘤和神经胶质瘤方面能够取得显著协同作用。

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤(癌症)治疗领域，具体涉及一种他汀与醋酸阿比特龙的组合物及其治疗神经母细胞瘤和神经胶质瘤的用途。

背景技术

神经母细胞瘤(Neuroblastoma，NB)是起源于胚胎交感神经系统的恶性肿瘤，病因未知。NB在儿科肿瘤中占8-10％，但是在小儿肿瘤致死病例中占15％。低风险NB病人5年生存率可以达到80-90％，但是尽管经过各种治疗，高风险NB病人5年生存率不到50％。大概40％的NB病人属于高风险，他们对一线治疗没有应答或在2年内复发。所以找到有效的诊断、治疗手段，发现新的治疗靶点是临床上急需的。

神经胶质瘤(以下称胶质瘤)是最常见的脑部肿瘤，其特点是预后极差，极易复发(几乎100％)，复发即为高级别。有报道称中国胶质瘤年发病率为3-6人/10万人，年死亡人数达3万人。世界范围内年发病率大约为7人/10万人，成人高级别胶质瘤的1年及5年生存率分别约为30％和13％，间变性胶质瘤及多形性胶质母细胞瘤(GBM)的中位生存时间分别约为2～3年和1年。尽管胶质瘤治疗技术水平不断在进步，患者的预后依然很差，医患面临的困境是用于胶质瘤治疗的化疗药物种类十分有限，且总体疗效不令人满意，原因是很多化疗药无法透过血脑屏障，且现阶段的治疗策略远没有达到个体化治疗。应用替莫唑胺(TMZ)治疗是目前的一线治疗策略，尽管临床数据显示，这种治疗方式对延长生存期有效(仅增加2.5个月)，但是很多情况下会出现药物抵抗和复发，所以新的治疗靶点及靶向化疗药物是胶质瘤研究的最重要方向。

他汀类药物，即3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)抑制药，是目前最有效的降脂药物，不仅能强效地降低总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)，而且能一定程度上降低三酰甘油(TG)，还能升高高密度脂蛋白(HDL)。其作用机制是通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶HMGCR，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面低密度脂蛋白(LDL)受体数量和活性增加，使血清胆固醇清除增加、水平降低。临床上主要用于降低胆固醇尤其是低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)，适于高胆固醇血症和以胆固醇升高为主的混合型高脂血症，防治冠心病、心肌梗死、脑卒中，延缓动脉粥样硬化，也有一些用于癌症治疗的报道。

醋酸阿比特龙是CYP17A1抑制剂，通过抑制CYP450c17酶而抑制雄激素的合成。醋酸阿比特龙还可以通过降低肿瘤活性标志物——“前列腺特异性抗原(PSA)”的水平，为那些已经采用药物治疗或经手术切除而肿瘤仍然增长的前列腺癌患者提供新的有效治疗途径。醋酸阿比特龙最初由British Technology Group Ltd.合成，主要用于治疗既往接受含多烯紫杉醇(docetaxel)化疗转移去势难治性前列腺癌患者，在我国批准的适应症为“与泼尼松联合治疗用于转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)”。体外研究已经证实两种药物各自单独使用时都存在一定的抑制胶质瘤增殖效果，但他汀与醋酸阿比特龙并没有联合用药报道，也没有使用它们抑制神经母细胞瘤增殖的报道。

药物的不良反应限制了药物的使用，也给医患带来额外困扰：他汀类药物的常见不良反应与用药剂量密切相关，主要是肌病和肝脏不良反应，其他还有胃肠反应、皮肤潮红、头痛等。他汀相关性肌病临床表现包括肌痛、肌炎和横纹肌溶解。出现肌炎及严重横纹肌溶解的病例是比较罕见的，且多发生在合并多种疾病和(或)联合使用多种药物的患者。横纹肌溶解常表现为CK(磷酸激酶)显著升高(高于正常值上限10倍以上)，可能伴有血肌酐升高，且常伴有肌球蛋白尿和肌球蛋白血症，并可引起急性肾衰竭。肝功能受损的表现为血清谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)水平升高，在接受他汀治疗的患者中，仅约1％-2％出现肝酶水平较高幅度升高(超过正常值上限3倍)，肝酶增高多为一过性，多发生在开始治疗或增加剂量的前3个月，一般停药后肝酶水平即可下降。醋酸阿比特龙有肝毒性且使盐皮质激素水平增加造成液体潴留，最常见不良反应(≥5％)是关节肿胀或不适，低钾血症，水肿，肌肉不适，热潮红，腹泻，泌尿道感染，咳嗽，高血压，心律失常，尿频，夜尿，消化不良，和上呼吸道感染。而联合用药如果存在协同作用会在一定程度上改善不良反应。

两种以上的药物合用时，倘若它们的作用方向是一致的，达到彼此增强的效果称为协同作用，其总的效应超过各药单用时效应的总和。两种存在协同作用的药物联合用药可以降低用药剂量，减少毒性/不良反应，又能减少出现耐药的可能性。

附图说明

图1.雄激素受体(AR)-固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)-固醇调节元件结合蛋白(SREBP1/2)-细胞色素P450-17A1(CYP17A1)/3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)途径正反馈调节神经母细胞瘤和胶质瘤进展。

图2.NB细胞系和胶质瘤细胞系使用不同浓度辛伐他汀处理72小时后细胞活力分析。

图3.NB细胞系和胶质瘤细胞系使用不同浓度氟伐他汀处理72小时后细胞活力分析。

图4.NB细胞系和胶质瘤细胞系使用不同浓度醋酸阿比特龙处理72小时后细胞活力分析。

图5.辛伐他汀(左)或氟伐他汀(右)与醋酸阿比特龙联合用药72h抑制SH-SY5Y生长。

图6.辛伐他汀(左)或氟伐他汀(右)与醋酸阿比特龙联合用药72h抑制Neuro2A生长。

图7.辛伐他汀(左)或氟伐他汀(右)与醋酸阿比特龙联合用药72h抑制SK-N-BE(2)生长。

图8.辛伐他汀(左)或氟伐他汀(右)与醋酸阿比特龙联合用药72h抑制T98G生长。

图9.辛伐他汀(左)或氟伐他汀(右)与醋酸阿比特龙联合用药72h抑制U87MG生长。

图10.辛伐他汀(左)或氟伐他汀(右)与醋酸阿比特龙联合用药72h抑制SK-N-BE(2)生长。

图11.辛伐他汀(S)或氟伐他汀(F)与醋酸阿比特龙(A)单独或联合用药(SA或FA)48h抑制三种NB细胞系AR-SCAP-SREBP2-CYP17蛋白表达。

图12.辛伐他汀(S)或氟伐他汀(F)与醋酸阿比特龙(A)单独或联合用药(SA或FA)48h抑制三种胶质瘤细胞系AR-SCAP-SREBP2-CYP17蛋白表达。

发明内容

本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)抑制剂和CYP17A1抑制剂。

同时，本发明提供一种3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)抑制剂和CYP17A1抑制剂在制备用于治疗神经母细胞瘤或神经胶质瘤的药物组合物中的用途。

进一步的，所述HMGCR抑制剂选自他汀类药物，优选为辛伐他汀或氟伐他汀或其组合。

进一步的，所述CYP17A1抑制剂为醋酸阿比特龙或其盐。

所述组合物还包含药学上可接受的药物载体和/或辅料。

发明人的研究证实了神经胶质瘤和神经母细胞瘤的共同点是：雄激素受体(AR)信号通路在NB和胶质瘤中被激活，临床上有94％的高级别胶质瘤(WHO III-IV)存在AR高表达，NB和胶质瘤细胞系中均存在AR高表达，并且这些细胞系的生长依赖雄激素(睾酮或类似物)，雄激素抑制剂/雄激素受体拮抗剂，例如MDV3100(Enzalutamide)、ARN509可以抑制NB和胶质瘤细胞生长。申请人提出NB和胶质瘤存在AR-SCAP-SREBP1/2-HMGCR/CYP17A1正反馈途径促进了自身生长或进展(图1)：AR高表达增加固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)转录，SCAP促进固醇调节元件结合蛋白1/2(SREBP1/2)成熟，SREBP1/2的N端片段调节CYP17A1和HMGCR转录。HMGCR和CYP17A1分别是由乙酰辅酶A合成胆固醇(Cholesterol)和由胆固醇合成睾酮(Testosterone)的限速酶，二者转录增加使NB和胶质瘤细胞自分泌睾酮增加，促进了AR活力，使肿瘤增殖、迁移、侵袭能力增加，加剧了肿瘤进展。其中他汀类药物(Statins)与阿比特龙或醋酸阿比特龙(Abiraterone Acetate)分别是HMGCR与CYP17A1的抑制剂。

从此机理出发，在体外实验中HMGCR或CYP17A1的抑制剂(氟伐他汀、辛伐他汀、醋酸阿比特龙)单用可以抑制NB及胶质瘤细胞(瑞舒伐他汀抑制NB及胶质瘤细胞增殖的作用弱)，而二者联用存在协同作用，增加了肿瘤细胞对药物的敏感性，降低了各种药物的使用浓度，也因此可以降低各自副反应。

具体实施方式

实施例1：具体实验方案

1)细胞培养：人NB细胞系SH-SY5Y，鼠NB细胞系Neuro2A，人胶质瘤细胞系T98G、U87MG、U118MG培养在DMEM中，而人NB细胞系SK-N-BE(2)培养在DMEM/F12(50/50)中，DMEM或DMEM/F12中加入了10％FBS及1％青霉素-链霉素，细胞培养在96孔板中(每孔100μl培养基)，5％CO₂，37℃条件下。

2)药物处理：他汀溶于DMSO，醋酸阿比特龙溶于乙醇(药物购自MCE，China)，培养体系中加入指定浓度的药物72小时后进行细胞活力检测，每种药物每个浓度设置5个平行孔。

3)细胞活力检测：MTT方法检测单独使用药或联合的细胞活力，药物处理72h后，96孔板上每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml)，孵育4h，小心吸去孔内培养液终止反应，每孔加入150ul二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm及630nm处测量各孔的吸光值。实验重复3次，数据输入GraphPad作图并进行统计分析，并得出IC50，误差线代表标准差，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。

实施例2：用药方式及结果

(1)单独用药

检测的细胞系为分别使用不同浓度氟伐他汀、辛伐他汀、醋酸阿比特龙处理72小时，结果如图2-图4.

(2)联合用药

应用一种他汀和醋酸阿比特龙联合处理以上各种细胞系72小时，细胞活力变化如图(图5-图10)，联合用药时每种药物浓度为单独用药的1/2。

实施例3：结果分析

单独用辛伐他汀或氟伐他汀处理72h后，各种细胞的活力曲线如图2和图3，各种细胞均表现出随着辛伐他汀或氟伐他汀浓度升高而细胞活力降低，其中神经母细胞瘤中Neuro2A、胶质瘤中T98G对辛伐他汀更敏感。

单独用醋酸阿比特龙处理72h后，各种细胞的活力曲线如图4，各种细胞均表现出随着醋酸阿比特龙浓度升高而细胞活力降低，其中神经母细胞瘤中SH-SY5Y、胶质瘤中T98G对辛伐他汀更敏感。各细胞系药物处理的半数抑制剂量IC50见表1。

联合用药72h，尽管每种药物浓度为单独用药的1/2，但对细胞增殖的抑制比单独用药更显著(p＜0.05)。图5中辛伐他汀(左)或氟伐他汀(右)与醋酸阿比特龙联合用药72h抑制SH-SY5Y生长，显示出协同作用(Control，溶剂对照；S，单独使用4μM辛伐他汀；AA，单独使用1μM醋酸阿比特龙；SA，2μM辛伐他汀和0.5μM醋酸阿比特龙联用；F，单独使用6μM氟伐他汀；FA，3μM氟伐他汀和0.5μM醋酸阿比特龙联用)。图6中辛伐他汀(左)或氟伐他汀(右)与醋酸阿比特龙联合用药72h抑制Neuro2A生长，显示出协同作用(Control，溶剂对照；S，单独使用1.5μM辛伐他汀；AA，单独使用2μM醋酸阿比特龙；SA，0.75μM辛伐他汀和1μM醋酸阿比特龙联用；F，单独使用0.5μM氟伐他汀；FA，0.25μM氟伐他汀和1μM醋酸阿比特龙联用)。图7中辛伐他汀(左)或氟伐他汀(右)与醋酸阿比特龙联合用药72h抑制SK-N-BE(2)生长，显示出协同作用(Control，溶剂对照；S，单独使用6μM辛伐他汀；AA，单独使用2μM醋酸阿比特龙；SA，3μM辛伐他汀和1μM醋酸阿比特龙联用；F，单独使用3μM氟伐他汀；FA，1.5μM氟伐他汀和1μM醋酸阿比特龙联用)。图8中辛伐他汀(左)或氟伐他汀(右)与醋酸阿比特龙联合用药72h抑制T98G生长，显示出协同作用(Control，溶剂对照；S，单独使用1.2μM辛伐他汀；AA，单独使用2μM醋酸阿比特龙；SA，0.6μM辛伐他汀和1μM醋酸阿比特龙联用；F，单独使用1.5μM氟伐他汀；FA，0.75μM氟伐他汀和1μM醋酸阿比特龙联用)。图9中辛伐他汀(左)或氟伐他汀(右)与醋酸阿比特龙联合用药72h抑制U87MG生长，显示出协同作用(Control，溶剂对照；S，单独使用10μM辛伐他汀；AA，单独使用2μM醋酸阿比特龙；SA，5μM辛伐他汀和1μM醋酸阿比特龙联用；F，单独使用3μM氟伐他汀；FA，1.5μM氟伐他汀和1μM醋酸阿比特龙联用)。图10中辛伐他汀(左)或氟伐他汀(右)与醋酸阿比特龙联合用药72h抑制SK-N-BE(2)生长，显示出协同作用(Control，溶剂对照；S，单独使用4μM辛伐他汀；AA，单独使用3μM醋酸阿比特龙；SA，2μM辛伐他汀和1.5μM醋酸阿比特龙联用；F，单独使用3μM氟伐他汀；FA，1.5μM氟伐他汀和1.5μM醋酸阿比特龙联用)。

他汀与醋酸阿比特龙显示出协同作用。联合用药时各药物浓度远小于IC50也可将细胞活力控制在50％及以下(图5-10)，尤其是辛伐他汀和醋酸阿比特龙联合，使用浓度(表2中的浓度)可以大大降低，因此可以降低药物的不良反应。

表1.细胞系使用不同药物处理72小时的半数抑制剂量IC50(μM)

表2.联合用药浓度表(μM，对应图5-图10中SA或FA)

实施例4：具体实施方案

1)细胞培养同实施例1，

2)药物处理同实施例2，药物浓度同表2，

3)处理过的细胞经细胞裂解(裂解液成分：50mM pH7.4Tris-HCl，2mM EDTA，1％TritonX-100，0.1％SDS，150mM NaCl，1mM PMSF)，离心取上清，BCA法蛋白浓度测定，30ug总蛋白样品(约10-15ul)用于10％SDS-PAGE，凝胶上的蛋白200mA恒流2小时转移至PVDF膜。PVDF膜用PBST(含5％脱脂奶粉和0.5％Tween-20的PBS)室温封闭30分钟用于免疫印迹检测蛋白表达。一抗室温孵育1小时或4摄氏度孵育过夜，PBST中洗涤3次，每次10min，HRP-二抗室温孵育1小时，PBST中洗涤3次，PVDF膜置于凝胶成像仪上用ECL发光液反应适当时间拍照，结果如图11和图12.

他汀、醋酸阿比特龙单或合用48小时(应用表2中的浓度)，免疫印迹结果显示：药物合用对AR、SREBP2-N、CYP17A1和SCAP都具有十分明显的抑制作用，即这些蛋白的表达水平降低。三种NB细胞系药物处理结果如图11。三种胶质瘤细胞系药物处理结果如图12。此结果与实施例2中的结果共同证实了“NB和胶质瘤存在AR-SCAP-SREBP1/2-HMGCR/CYP17A1正反馈途径促进了自身生长或进展”这一机制。联合用药显示出比单独用药对这一途径更明显的抑制。