Contaminant mixtures and repoductive health: Developmental toxicity effects in rats after mixed exposure to environmentally relevant endocrine disrupting chemicals, with focus on effects in females

摘要

Baggrund: I toksikologisk testning bliver effekter af hormonforstyrrende stoffer ofte undersøgt mere grundigt hos hanner end hos hunner. Hos hanner findes hypotesen om testikulært dysgenese syndrom (TDS), der siger at der er en fælles oprindelse i fostertilværelsen for blandt andet den øgede forekomst af drenge født med hypospadi og unge mænd med lav sædkvalitet, der er set i befolkningen i de senere år. Samtidig kan eksponering for hormonforstyrrende stoffer i fostertilværelsen hos forsøgsdyr medføre lignende effekter på forplantningsevnen og udsættelse for hormonforstyrrende stoffer mistænkes for at medvirke til de ovennævnte effekter på mennesker. Det er blevet foreslået, at et lignende syndrom, kaldet ovarie dysgenese syndrom (ODS), også findes hos hunner. Dette syndrom omfatter ligeledes ændringer af udviklingen af reproduktionssystemet blandt andet som følge af kemisk eksponering, og kan resultere i nedsat frugtbarhed, sygdomme i graviditeten, gynækologiske lidelser og sygdomme senere i livet. Der har imidlertid manglet viden om effekten af eksponering under udviklingen for miljørelevante hormonforstyrrende stoffer i hunner. Da kemisk eksponering kan påvirke den hunlige reproduktive udvikling, er det vigtigt at undersøge effekter hos hunner både tidligt og senere i livet.Metoder: De resultater, som præsenteres i denne afhandling, er fra fem toksikologiske studier, hvor parrede Wistar hunrotter blev doseret peroralt med miljørelevante stoffer alene eller i blandinger i drægtigheds- og laktationsperioden. To studier undersøgte blandinger (miks) af hormonforstyrrende pesticider (Pestimix), to undersøgte en blanding af hormonforstyrrende kemikalier baseret på human eksponering (Contamed), og i et studie blev der testet en positiv kontrol for østrogene effekter, lægemidlet ethinylestradiol (EE2). Projektet med blandingen af de fem pesticider omfattede to pilot studier (samlet kaldet Pestimix RF) og et dosisrespons studie (Pestimix DR). I Contamed projektet blev der testet blandinger af kemikalier, som var modelleret ud fra den høje ende af hvad mennesker kan være udsat for. Projektet omfattede to rottestudier, kaldet Contamed 1 og 2. I disse studier blev 13 kemikalier blandet, hvor data om in vivo hormonforstyrrende effekter og information om menneskelig eksponering var til rådighed. De testede stoffer inkluderede phthalater, pesticider, UV-filtre, bisphenol A, parabener og lægemidlet paracetamol. Sammen repræsenterede kemikalierne flere hormonforstyrrende virkemåder/mekanismer. Endelig er resultaterne fra et dosis-respons forsøg med det østrogene stof EE2 inkluderet. I alle disse undersøgelser blev både han og hun -afkom undersøgt for effekter af eksponeringen, men de endpoints, der blev fokuseret på i denne afhandling, var dem der ses hos hunnerne. De undersøgte endpoints var drægtighedslængde i de drægtige hunner, og i det hunlige afkom anogenital afstand (AGD), antallet af brystvorter, alder for pubertet, målinger af anti -müllerian hormon (AMH) samt østrus cyklus på adskillige tidspunkter i løbet af dyrene levetid.Resultater og diskussion: Forlænget drægtighedslængde blev observeret i Pestimix studierne i grupper doseret med blanding/miks af pesticider, ved doser langt under deres individuelle NOAEL for dette endpoint (”No Observed Adverse Effect Level ”), dvs. den højeste dosis af stoffet, som i dyreforsøg ikke har givet nogen skadelige effekter. Effekterne af miksen blev formentlig forårsaget af azol fungiciderne epoxiconazol og tebuconazol samt prochloraz som tidligere har vist sig at give denne form for effekt. Længere drægtighedslængde blev også observeret i drægtige rottemødre fra EE2 studiet ved den højeste dosis. AGD i hunafkom var øget i både Pestimix RF-studiet og DR studiet. Her blev set effekter i de to højeste miks-grupper, samt hos hunrotter, der modtog epoxiconazol, prochloraz og tebuconazol ved doser svarende til dem, der indgik i den højeste miksdosis. Effekterne i miks-grupperne blev formentlig forårsaget af epoxiconazol, tebuconazol og prochloraz, som tidligere har vist sig at påvirke AGD hos hunrotter. En øget AGD blev også observeret ved den højeste dosis i EE2 studiet. Tidspunktet for pubertetens indtræden blev ikke påvirket i nogen af de udførte forsøg, selv i EE2 studiet, som var en p ositiv kontrol. Det anbefales dog, at registreringen i fremtidige studier påbegyndes i en tidligere alder end ungedag 27, som viste sig at være for sent, fordi nogle dyr allerede havde nået puberteten i den alder. En stigning i antallet af brystvorter blevobserveret i den høje dosisgruppe i EE2 studiet. Mekanismen bag denne virkning er ikke kendt. Østrus cyklus blev ikke påvirket i Pestimix DR, men data var ikke optimale da metodologiske vanskeligheder forårsagede at en stor del af dyrene blev pseudogravide. I de to Contamed studier var der ingen effekt på østrus cyklus i dyrene i 3, 5 eller 9-10 måneders alderen. Men efter 12 måneder havde flere dyr uregelmæssig cyklus i den højeste miksdosis-gruppe sammenlignet med kontroller. Dette indikerer en tidligere reproduktiv ældning (menopause/overgangsalder i mennesker). Dette er et vigtigt resultat, da for tidlig menopause er en alvorlig effekt, og de fleste studier vil overse sådan en effekt, fordi studierne afsluttes for tidligt til at observere den. Der var også et signifikant fald i AMH niveauer i 4 måneder gamle dyr i højeste miksdosis-gruppe og i gruppen behandlet med paracetamol. Der blev hverken observeret effekt på AMH i de ældre dyr eller i de 3 måneder gamle dyr i EE2 studiet. Der skal mere viden til for at afgøre om AMH kan være en god markør for effekter af hormonforstyrrende stoffer på ovariefollikelreserven hos rotter. Power beregninger afslørede at generelt kan man måle omkring en 50% ændring både for effekter på østrus cyklus og AMH.Konklusion: Hunrotter viste sig at være følsomme for eksponering med blandinger af hormonforstyrrende stoffer. I alle 5 studier blev drægtige rotter og /eller hunligt afkom påvirket ved eksponering for de enkelte kemikalier eller miks af hormonforstyrrende kemikalier ved de undersøgte doser. For første gang er der rapporteret mixeffekter på gestationslængden hos drægtige rotter. I afkommet blev der set effekter på AGD, antal brystvorter, østrus cyklus og AMH niveauer, men ikke tidspunkt for pubertet. Effekter på østrus cyklus blev kun set hos de et år gamle rotter og er et tegn på sene effekter af tidlig eksponering. Resultaterne indikerer at hormonforstyrrende stoffer kan være medvirkende faktor til effekter i reproduktionssystemet hos voksne kvinder og ufødte pigebørn. AMH skal undersøges bedre for at vurdere om det er en god markør for effekter af hormonforstyrrende stoffers effekt på ovariefollikelreserven. Mere følsomme endpoints ville være nyttige ved vurderingen af effekter hos hunner og bør være i fokus i fremtidigt arbejde.