Molekulare und zelluläre Mechanismen der Kontrolle adulter neuraler Stamm- und Vorläuferzellen durch Transforming Growth Factor-beta1 (TGF-beta1)

摘要

Nach dem derzeitigen Stand der Wissenschaft existieren im adulten Gehirn zwei Regionen, in denen während des gesamten Lebens neue Nervenzellen gebildet werden: Dies ist zum einen die Subventrikulärzone (SVZ) der lateralen Ventrikel und zum anderen die Subgranulärschicht im Gyrus dentatus (GD) des Hippocampus (HC). Die kontinuierliche Bildung von Nervenzellen (Neurogenese) innerhalb dieser Areale basiert auf der Präsenz von neuralen Stammzellen, die sich durch ihre Fähigkeit zur unbegrenzten Selbsterneuerung durch Teilung und das Potential zur Differenzierung in gliale (Astrozyten, Oligodendrozyten) und neuronale Zelltypen (Neurone) auszeichnen. Die Proliferation neuraler Stammzellen wird, neben weiteren Einflüssen, unter anderem durch Wachstumsfaktoren reguliert. Ein Faktor, der die Proliferation einer Vielzahl von Zellen moduliert, ist Transforming Growth Factor-beta1 (TGF-beta1). Im intakten Gehirn findet man das pleiotrope Zytokin vorwiegend im choroidalen Plexus und der Hirnhaut vor. Unter pathologischen Bedingungen wie Schlaganfall, Parkinson, Multiple Sklerose usw. wird der Wachstumsfaktor vorwiegend in Mikroglia, aber auch von neuronalen und astroglialen Zellen, in erhöhtem Maße exprimiert. Die Expression des für die Signalübertragung erforderlichen Rezeptors, TGFRII, lässt sich in beiden neurogenen Regionen des adulten Gehirns nachweisen; TGFRII-mRNA wird dort unter anderem in Neuronen, Astroglia und Mikroglia vorgefunden. Experimentelle Untersuchungen an Zellen aus der SVZ belegen, dass TGFRII-mRNA (und -Protein) darüber hinaus auch in adulten neuralen Stamm- und Vorläuferzellkulturen (aNSZ-Kulturen) exprimiert wird. Weiterführende Analysen konnten zudem zeigen, dass der Wachstumsfaktor TGF-beta1 das proliferative Potential dieser Kulturen verringert, während er das Selbsterneuerungs- und Differenzierungspotential nicht beeinflusst. Darüber hinaus sind die molekularen und zellulären Mechanismen der Kontrolle aNSZ durch TGF-beta1 jedoch weitgehend unbekannt, wenngleich verschiedene Aspekte zusätzliche Funktionen, unter anderem in Bezug auf das Zellschicksal aNSZ, vermuten lassen. Die vorliegende Arbeit beschreibt 1) die TGF-beta1-induzierte Regulation von 619 Genen in aNSZ-Kulturen unter Proliferationsbedingungen. Die signifikant regulierten Gene wurden im Rahmen der Identifizierung biologischer Funktionen unter anderem den „Gene Ontology“-Kategorien „Zellproliferation“ und „-wachstum“, „Regulation der Zellproliferation“, „Regulation des Zellzyklus“, „Neuron Reifung“, „Neuron Differenzierung“, „Determinierung des Zellschicksals“ sowie „Neurogenese“ zugeordnet. Die Arbeit zeigt außerdem, dass TGF-beta1 2) die Expression der zur Signalübertragung relevanten Rezeptoren tangiert; während die Expression von TGFRI unverändert blieb, wurde eine reduzierte Expression des alternativen TGFRI, Acvrl1, sowie eine signifikant erniedrigte TGFRII-Expression deutlich. 3) inhibitorisch auf die Zellproliferation aNSZ wirkt, indem es eine Teilpopulation der Zellen dazu veranlasst, aus dem Zellzyklus auszutreten; die Überführung in die G0-Phase resultierte in einer verminderten S-Phase bei konstanter G1- und G2/M-Phase-Fraktion im Vergleich zu Kontroll-Kulturen. 4) die Zellidentität proliferierender aNSZ beeinflusst. So führte die Inkubation aNSZ mit TGF-beta1 nachweislich zu einer verminderten Expression des neuroektodermalen Stammzellmarkers Nestin (Nes) und des oligodendroglialen Markers Myelin basic protein (Mbp), während sich die Zahl der Glial fibrillary acidic protein (GFAP)-positiven Astrozyten nicht signifikant änderte. Gleichzeitig erhöhte TGF-beta1 die Expression des neurogenese-assoziierten Proteins Doublecortin (Dcx), welches spezifisch in neuronalen Vorläuferzellen exprimiert wird. 5) Der Anstieg der neuronalen Zellpopulation in TGF-beta1-behandelten Kulturen spiegelte sich in einer zunehmenden Dichte der Natriumströme wider und korrelierte mit der Existenz von Aktionspotentialen. In Kontroll-Kulturen waren dagegen keine Natriumströme detektierbar; dementsprechend war keine der vermessenen Zellen in der Lage, infolge der Strominjektion ein Aktionspotential auszulösen. Im Gegensatz dazu ließen unter Differenzierungsbedingungen weder kontroll- noch TGF-beta1-behandelte Zellen Natriumströme erkennen, sodass es beiden Kulturen nicht möglich war, Aktionspotentiale zu generieren. Weiter verweist die vorliegende Arbeit auf 6) den Einfluss von TGF-beta1 auf aNSZ unter gezielten, oligodendroglialen Differenzierungsbedingungen. Die im Anschluss an die Differenzierung durchgeführte Analyse ergab - jeweils in Übereinstimmung mit den Daten, die unter Proliferationsbedingungen generiert wurden - keinen Einfluss auf die GFAP-Expression, allerdings eine signifikant reduzierte Anzahl an Mbp-exprimierenden Zellen. Des Weiteren führte die Kultivierung in mesenchymal-konditioniertem Medium zu einem vollständigen Verlust der Population A2B5-positiver, glialer Vorläuferzellen durch TGF-beta1, wohingegen der Wachstumsfaktor keinen Einfluss auf die Microtubule associated protein 2ab (Map2ab)-Expression zu haben schien. 7) die neuroprotektive Wirkung, welche TGF-beta1 auf aNSZ-Kulturen entfaltet. Die Inkubation aNSZ mit TGF-beta1 resultierte im Ausbleiben des spezifischen, mit Apoptose assoziierten Lipid-Signals bei 1.28 ppm, welches in Kontroll-Kulturen nachweisbar war. Die Quantifizierung des 1.28-ppm-Peaks ergab eine signifikant erniedrigte Lipid-Signalintensität in TGF-beta1-behandelten Zellen im Vergleich zur Kontrolle. Darüber hinaus zeigten die erhobenen Daten, dass TGF-beta1 aNSZ sowohl vor nekrotischem Zelltod bewahrt als auch den Anteil an apoptotischen Zellen im Vergleich zur Kontrolle signifikant reduziert. 8) die - schon nach wenigen Tagen - verminderte Anzahl proliferierender Spheres in TGF-beta1-behandelten Kulturen, wenn TGF-beta1 von Beginn der Kultur an ins Nährmedium zugesetzt wurde. TGF-beta1-behandelte Kulturen wiesen außerdem, im Gegensatz zu Kontroll-Kulturen, adhärente Zellen mit teils neuron-artiger Morphologie auf. Darüber hinaus zeigten sich schon bald deutliche Unterschiede die Spheregröße betreffend; während in TGF-beta1-behandelten Kulturen nur vereinzelt Spheres von zudem geringer Größe anzutreffen waren, enthielten die Kontrollzellen eindeutig mehr und bei Weitem größere Spheres. Dementsprechend waren die ermittelten Zellzahlen am Ende von Passage 1 stark unterschiedlich. Die kontroll-behandelte Kultur expandierte stark; die Zellzahl der TGF-beta1-behandelten Kultur lag jedoch deutlich unter der ursprünglich ausgesäten Zahl an Zellen. Letztlich starben die TGF-beta1-behandelten Zellen nach der dritten Passage innerhalb weniger Tage. Die durch die vorliegende Arbeit gewonnenen Erkenntnisse sind von großer Relevanz, um die zukünftige Entwicklung von Medikamenten für die Therapie neurodegenerativer Erkrankungen voranzutreiben. Auch im Rahmen neurorekonstruktiver Therapieansätze lassen sich die Ergebnisse nutzen, um beispielsweise Zellen im Vorfeld einer Transplantation neuronal zu determinieren.ud