Isolierung und Charakterisierung des porcinen c-Fos Protoonkogens im Hinblick auf Fleischfülle und Merkmalantagonismus beim Schwein

摘要

Im Rahmen dieser Arbeit wurde das porcine c-fos Protoonkogen vor dem Hintergrund seiner ausreichend dokumentierten Rolle alsTranskriptionsfaktor bei Zellwachstums- und Zelldifferenzierungsprozessen, vor allem auch im Rahmen von Muskelzellhypertrophie, isoliertund in Form der kompletten Sequenzierung und chromosomalen Lokalisierung charakterisiert. Weiterhin wurde die genetische Variabilitätdes Genes bei konstitutionell sehr unterschiedlichen Schweinerassen auf Sequenzebene untersucht. Für einzelne manifest gewordeneSequenzpolymorphismen wurden PCR/Restriktionssteme zur Typisierung größeren Tiermaterials entwickelt. Die Ergebnisse lassen sich folgendermaßen zusammenfassen: Das c-fos Protoonkogen wurde mittels einer schweinespezifischen Sonde aus einer Lambda-FixII-Genbank vom Schwein isoliert, inPlasmidvektoren subkloniert, und in einer Ausdehnung von insgesamt 4200 bp sequenziert ( EMBL Acc.No.AJ132510 ). Auf der Basis vonHomologievergleichen zu anderen Spezies konnte der charakteristische Aufbau des Genes mit den 4 Exon- und 3 Intronbereichen sowieden funktionell wichtigen Domänen und Promotorelementen dokumentiert werden. Das c-fos Gen kodiert für ein 380 Aminosäuren zählendes Protein mit dem charakteristischen bZIP-Motiv als funktionell wichtigsterBereich. Die Homologie zum Menschen beträgt für das gesamte Gen 84,8%, im Bereich der funktionell wichtigen Domäne der basischen Regionund des Leucin-Zippers befinden sich keine Basenaustausche. Mit Hilfe eines Schweine-Nager-Zellhybridpanels konnte c-fos auf dem ChromosomSSC 7q12-23 oder q26 lokalisiert werden. DurchSynthenievergleiche mit dem Menschen konnte der wahrscheinliche Lokalisationsort auf SSC 7q23 begrenzt werden. Die Suche nach Sequenzunterschieden zwischen konstitutionell unterschiedlichen Rassen erfolgte mittels spezifisch entwickelterPCR-Systeme zur Amplifikation definierter Sequenzabschnitte mit anschließender Sequenzierung. So konnten für die Rassen Pietrain undMeishan detaillierte Sequenzinformationen über insgesamt 3579 bp des Genes erhalten werden. Insgesamt zeigten sich im Vergleich zur Genbanksequenz zehn Basenaustausche. Davon befinden sich interessanterweise fünf im Bereichdes Exon 4, zwei davon gehen mit einem Aminosäurenaustausch auf der Proteinebene einher. An Position 2910 befindet sich beimMeishan im Gegensatz zum Pietrain ein Guanin anstelle eines Adenins, was auf Proteinebene den Austausch eines Asparagins durch einSerin bedeutet. Dieser Polymorphismus zeigt sich auch zwischen den Spezies, wo Mensch und Hamster die gleiche Sequenz wie dasMeishan zeigen. Maus und Ratte sind hier identisch mit Pietrain und der Genbanksequenz. Des weiteren ist an Position 2997 beimPietrain ein Guanin durch ein Adenin ersetzt wodurch es zum Austausch eines Arginins durch ein Histidin auf Proteinebene kommt. DieserAustausch wiederholt sich nicht bei anderen untersuchten Spezies. Bei den restlichen handelt es sich um stille Mutationen ohne direkte Auswirkung auf die Proteinzusammensetzung von c-Fos. Alle weiteren Austausche befinden sich im untranslatierten Bereich des Genes, zwei auf Höhe des Intron 1, einer im Intron 3-Bereich undschließlich zwei im Bereich des vorderen 3´Endes. Der mittlere Bereich des Genes von Position 1257 bis Position 2443 mit Teilen desIntron 1 sowie der gesamten Intron 2 und 3 und der Exons 2 und 3 weist keine Unterschiede in der Nukleotidfolge zwischen denuntersuchten Tieren auf. Auch das Exon 1 zeigt keine Sequenzunterschiede. Die gefundenen Basen- und Aminosäurenaustausche bedürfen der Verifizierung an größeren Tierzahlen. Zu diesem Zwecke wurden füreinzelne Austausche PCR/Retsriktionssysteme entwickelt, die eine Typisierung größeren Probenmaterials ermöglichen. Ein TaqI-Restriktionspolymorphismus entsteht durch den Basenaustausch an Position 2544. Der erste Austausch im Exon 4 an Position 2650 bewirkt einen AluI-Restriktionpolymorphismus. Der mit einem Aminosäurenaustausch einhergehende Polymorphismus an Position 2910 läßt sich durch einenTaiI-Restriktionspolymorphismus nachweisen. Alle hier aufgezeigten RFLP´s müssen anhand von größeren Tierzahlen überprüft werden. Durch das Screenen geeigneten Familienmaterials können dann Assoziations- und Segregationsstudien erfolgen.