Конструирование и изучение свойств авирулентного генетически измененного штамма Vibrio cholerae биовара Эль Тор с инактивированными генами термолабильного гемолизина и эффективной экспрессией клонированного гена В-субъединицы холерного токсина

摘要

Представлены результаты конструирования авирулентного штамма геноварианта V. cholerae O1 серогруппы биовара Эль Тор с эффективной продукцией В-субъединицы холерного токсина (СТ), обеспечивающей формирование антитоксического иммунитета при холере. В начале исследования на основе нетоксигенного штамма геноварианта Р18899ΔСТХΦHly~+ путем ненаправленного транспозонного мутагенеза был получен модифицированный штамм Р18899ДСТХΦсЬг::ТпрЬоА (Km~RHly~- ), утративший способность продуцировать термолабильный гемолизин, который относится к дополнительным токсинам. Далее в клетки этого штамма был введен ген ctxB, кодирующий биосинтез В-субъединицы СТ. С этой целью была использована коинтегра-тивная рекомбинантная плазмида рΙЕМЗ, образованная за счет объединения конъюгативной плазмиды pIEM1 и неконъюга-тивной рСТА27, производной pBR322, несущей клонированный ген ctxB. С помощью рестрикционного анализа установлено, что в клетках холерного вибриона произошло разъединение коинтеграта с последующим сохранением лишь многокопийной плазмиды рСТА27. В результате были получены авирулентные клоны Km~RTc~R с высоким уровнем продукции секретируемой В-субъединицы СТ (5-6 мкг/мл), один из которых (Е99) был взят для дальнейших исследований. Методом ПЦР-РВ было обнаружено, что экспрессия плазмидного гена ctxB в клетках сконструированного штамма V. cholerae Е99 не зависит от активности ключевого регуляторного гена toxT, расположенного на хромосоме. Эффективная экспрессия гена ctxB в клетках Е99 позволяет использовать его для получения В-субъединицы СТ с целью изготовления холерных иммунобиологических препаратов.