日本眼科学会総会　宿題報告ⅠⅠ眼の再生医学　角膜内皮細胞移植

摘要

再生医療の技術を応用して，培養した角膜の細胞や人工実質を使い臨床応用可能な再構築角膜を作製できれば，角膜不足の解消，角膜移植の定時手術化，バンク化した角膜の細胞の使用などが可能となる．本研究では角膜の透明性維持に重要である角膜内皮細胞に焦点を当て，培養した角膜内皮細胞を用いて角膜を再構築することが可能であるかを検討した．今回，我々は仔ウシ角膜内皮細胞の産生する細胞外基質でコーティングした培養皿とbasic fibroblast growthfactorや胎児ウシ血清を含む培地を用いて初代培養することにより，ヒト角膜内皮細胞（human corneal endo－thelial cell， HCEC）の培養を安定して行うことに成功した．この培養HCECを用いて以下の検討を行った．培養HCECへのドナー年齢の影響をみたところ，継代培養されたHCECではドナー年齢が高いほど大型老化細胞が多く出現した．加齢に伴う生体内でのHCECの老化の原因を明らかにするために， HCECのテロメア長の測定をサザンプロットで行ったところ，生体内のHCECは70代でも12kbと長いテロメア長を有しておリ，継代培養していくと徐々にテロメア長が短縮したが，年齢の違いによるテロメア長の差はみられなかった．この結果から，加齢に伴う角膜内皮細胞の老化にテロメア長の短縮は関係ないことがわかった．さらに，HCECの老化の原因としてのadvanced glycation endpro血cts（AGE）の役割について検討した．前房水のAGE化蛋白が角膜内皮細胞に発現しているAGE受容体を介して内皮細胞中に取り込まれ，アポトーシスの誘導や活性酸素種の産生によリ，角膜内皮細胞傷害に働いていることがわかリ,AGEがHCECの老化の一因となっている可能性が示唆された．プリオン感染の危険性のあるウシ材料からの脱却を目指して，ウシ血清の代わリに成人血清を用いてHCECの培養を行った．成人血清を用いてHCECの効率的な初代および継代培養が可能であった．培養HCECとと卜角膜実質から角膜を再構築した．HCECの浮遊液を実質上に播種後，細胞接着を促進するために角膜片を遠心したところ，内皮細胞密度を2，500cells/mm~2まで高めることができた．この再構築角膜の内皮細胞のポンプ機能をワッシング·チャンバーで検討したところ，観察された電位差は正常角膜0．40mVに対して，再構築角膜で0.30mVと，再構築角膜は正常角膜内皮の75％のポンプ機能を有することが確認された．再構築角膜を白色家兎へ移植したところ，角膜の透明性が6か月間維持された．蛍光色素でラベルした培養HCECを用いた再構築角膜を家兎へ移植したところ，蛍光ラベルされたHCECが術1か月後も移植片上に保たれておリ，実質上に播種したHCECが，術後の移植片の透明性維持に働いていることがわかった．培養HCECのキャリアーとして，人工実質とブタ角膜実質の可能性を検討した．アルカリ可溶化コラーゲンを用いて作製した人工実質は，透明性·生体適合性·細胞接着性が良好であった．ブタ角膜では異種糖鎖抗原α－galエピトープの発現が少なく，カニクイサルの角膜層間にブタ角膜実質を移植したところ，超急性拒絶反応は起こさず細胞性拒絶反応を起こした．ブタ角膜実質と培養HCECを用いて作製した再構築角膜は平均で1，721cells/mm~2の細胞密度を持ち，ウッシング·チャンバー　 を用いた解析では，正常ブタ角膜内皮の60％程度のポンプ機能を示した．新しい角膜内皮細胞移植法として，自己未分化細胞の応用と，培養HCECの前房内投与法の可能性について検討した．ラット前房内へ投与されたラット骨髄中の単核球がDescemet膜上に接着して角膜内皮様に変化し，自己の未分化な細胞が角膜内皮様に変化できる可能性が示唆された．培養中に鉄を会食させた培養家兎角膜内皮細胞を，内皮傷害された家兎の前房内に投与した後，磁石でDescemet膜への接着を図る角膜内皮細胞移植法が有効であるか検討したところ，鉄会食角膜内皮細胞を投与した群では対照群と比較して早期に角膜浮腫が消退し，術後8週間にわたって眼圧上昇はみられず，培養角膜内皮細胞の前房内投与が有効であることがわかった．角膜内皮細胞移植の方法を臨床応用可能にするために何をなしていくべきか，という観点から今後の課題を考えると， ①正常角膜に匹敵するあるいはそれを超える機能·性状を有する再構築角膜を作製するためには，倫理的問題をクリアーした上で胎児などから採取し2~3代のごく少ない継代をした角膜内皮細胞を用いたり，播種した内皮細胞の密度や機能をさらに高める方法を開発したりするなど，角膜内皮細胞培養法や細胞播種法において，さらなる改良を加えていく必要がある． ②供給源に限りのあると卜角膜実質に代わる再構築角膜の実質としては，ブタ角膜実質が有望である．レトロウイルス感染を予防するため無細胞化したブタ角膜実質の有効性について今後検討していく予定である． ③自己未分化細胞の応用に関しては，角膜内皮細胞特異的マーカーの検索，体性幹細胞の角膜内皮への分化誘導に必要な因子の検討などを課題としてさらなる探求を進めたいと考えている． ④培養角膜内皮細胞の前房内投与は動物実験により長期的な安全性が確認できれば，有効な方法になリ得る．