PCRを用いた性判別におよばす牛胚のバイオプシー用培地中成分の影響

摘要

雌雄の牛精製DNAをテンプレートとして、ウシ胚性判別キット（伊藤ハム，XYセレケターTM）を用いでPCRの尿応条件を一定にし、牛血清アルブシン(BSA）、仔牛血清（CS）、ポリビニルピロリドン（PVO）、シュークロース（Suc）および胚操作用培地（PB1）が性判別結果にどの程度影響をおよぼすかについて検討した。 BSA（反応液中の最終濃度：0．1－2．0mg／ml）、PVP（0．1－2．0mg/ml）およびSuc（10－160mM）については、雌雄の精製DNA20および200pgで、用いたいずれの濃度においても正確に性を判定することができ、通常の胚操作に用いられる濃度範囲内ではPCRの反応には影響しなかった。 一方、CSについては精製DNA200pgでは、雌雄ともに性を正確に判定することができたが、雄の精製DNA20pgでは、雄特異的バンドが0．05％め濃度から全般的に薄く、2．0％CSにおいては雄特異的バンドは検出できなかった。PB1の影響を調づる実験では、全体の反応液量を20μlにするために超純水の液量を変動させ、PB1を2．0μl（x0．1）～8．0μl（x0．4）添加した。 雄の精製DNA20pgをテンプレートとした場合、x0．3PB1を越えると雄特異的ばかりでなく雌雄共通のバンドも検出されなかった。また、雄の精製DNA200pgをテンプレートとした場合でもx0．3PB1を越えると雄特異的バンドは検出されなかった。以上の結果より、胚のサンプリング時にはできるだけ血清の使用を避けること、および胚操作用培地などの持ち込み液量によって反応液量の構成成分の最終濃度に大きくズレが生じないようにすることが重要であると考えられた。