ニヮ卜リ腸管オルガノィド培養法の確立

摘要

腸管上皮細胞の実験系はCaco-2、 HT-29などのガ ン細胞由来の株化細胞が用いられてきた。しかし、 これらの細胞株はヒトの結腸ガン由来の細胞株であ り、正常細胞と特性が異なることや、異なる動物種 の実験系には適さないことが問題視されていた。し かし、2009年にSatoによって腸管オルガノィ ド培養による腸管上皮細胞の初代培養法が確立され た。これは、Coming社が提供している基底膜マト リクスであるマトリゲル中に腸管陰窩（クリブト） を包埋し、Wnt3a、 R-spondin、 NogginおよびEGF といったWntシグナル経路を活性化させるサイト 力インを添加した培養液で培養することで、腸管上 皮細胞の3次元培養を可能にした手法である。現在 ではヒトゃマウスに限らず、ブタといった畜産動物 においても培養法が可能となっており2)、 ニヮトリ でも培養が可能となることをPierzchalskaらが報告 している3_4)。通常、オルガノィドは成体から調製 される力s、彼らはニヮトリ胚から腸管オルガノィド 培養を行っている。しかし、胚の腸管からオルガノ ィド培養を行うと、未分化な状態のスフユロイド を形成することが明らかとなっており、DAPT(n-[(3,5-difluorophenyl) acetvl] -l-alanvl-2-phenyl] giycine-1，1-dimethylethyl ester)といったy -セクレターゼ阻 害剤の添加によりオルガノィドへの分化が必要とな る5)。そこで、本研究ではニヮトリ胚ではなく、成 体（成鶏）から採取した腸管から分化した腸管オル ガノィドの培養が可能となるか否か調査した。オル ガノィド培養では市販のリコンビナントのWnt3a、 R-spondinL Nogginが用いられているが、Wnt3aに関しては脂質修飾を受けなければ活性が低下するこ とが報告されている6)。また、リコンビナントタン パク質は高価であるため、培養にコストがかかり、大量培養を行うことが困難である。最近では、マウス線維芽細胞株にWnt3a、 R-spondin3、 Nogginの 遺伝子を組み込んだしWRN (CRL-3276)細胞が ATCC社から市販されており、この細胞株から得ら れたconditioned mediumからオルガノィド培養が可 能であることが報告されている7)。そこで本研究で はレWRN conditioned mediumを用いることにより、 ニヮトリ（成鶏）でもオルガノイド培養が可能か否 か調査した。また、本研究における腸管オルガノィ ド培養の手法はMaheら8)の手法を参考にした。