質量分析によるタンパク質?ペプチドC末端アミド化解析のための化学誘導体化を用いた新規手法について

摘要

C末端ペプチドの単離およびC末端カルボキシル基の高選択的な誘導体化を可能にする化学的手法を組み合rnわせ，質量分析計を用いてタンパク質?ペプチドのC末端カルボキシル基修飾の有無を判断する方法を開発しrnたので本稿で紹介する。この方法では，C末端カルボキシル基を選択的にメチルアミド（CONHCH_3）に変換し，rnその質量差を1Daから14Daに拡大することにより，C末端カルボキシル基がフリー（COOH）であるかもしrnくはアミド（CONH_2）であるかを正確に解析できる。C末端カルボキシル基以外のカルボキシル基はオキサゾrnロン形成による誘導体化に不活性であるため，本方法は側鎖上にカルボキシル基を有するアスパラギン酸およrnびグルタミン酸残基を含むペプチドにも適用できる。本方法はadrenomedullin，Calcitonin，BSAの混合物を一rnつのモデルとした検討を行い，一連のプロセスを経て得られたそれぞれのC末端ペプチドのピークの詳細比較rn解析により本方法の有効性が示された。すなわち，この混合物の成分中BSAのC末端ペプチドのみ一連の反rn応後に13Daの質量増加を示し，adrenomedullin，calcitoninのC末端ペプチドが反応しなかったことから，三rn種の成分中これら二つの生理活性ペプチドのC末端構造がアミドであることを明確に示すことができた。なrnお，C末端（翻訳後）修飾の解析のためのこの方法の拡張可能性も本稿中で考察する。%We describe a mass spectrometric method for distinguishing between free and modified forms of the C-terminal carboxyl group of peptides and proteins, in combination with chemical approaches for the isolation of C-terminal peptides and site-specific derivatization of the C-terminal carboxyl group. This method could most advantageously be exploited to discriminate between peptides having C-terminal carboxyl groups in the free (COOH) and amide (CONH_2) forms by increasing their mass difference from 1 Da to 14 Da by selectively converting the free carboxyl group into methylamide (CONHCH_3). This method has been proven to be applicable to peptides containing aspartic and glutamic acids, because all the carboxyl groups except the C-terminal one are inert to derivatization, according to oxazolone chemistry. The efficiency of the method is illustrated by a comparison of the peaks of processed peptides obtained from a mixture of adrenomedullin, calcitonin, and bovine serum albumin (BSA). Among these components of the mixture, only the C-terminal peptide of BSA exhibited the mass shift of 13 Da upon treatment, eventually unambiguously validating the C-terminal amide structures of adrenomedullin and calcitonin. The possibility of extending this method for the analysis of C-terminal PTMs is also discussed.