Development and Validation of Event-Specific Quantitative PCR Method for Genetically Modified Maize MIR604

摘要

遺伝子組換えトウモロコシMIR604 系統は食品原料として広く流通しており，当該系統に対する定量検知法が食品表示の検証のために必要とされている．本論文は，リアルタイムPCR を用いたMIR604 系統新規定量検知法について報告するものである．まず，MIR604 系統およびトウモロコシ内在性のスターチシンクーゼIIb 遺伝子に対するリアルタイムPCR を設計した．つづいて，MIR604 系統特異的DNAおよび内在性DNAのコピー数比から重量比によるGMトウモロコシ混入率を算出するために必要となる内標比を決定した．最後に，分析法の妥当性を確認するため，MIR604系統を0,0.5,1.0,5.0,10.0％含むブラインド試料を調製し，国際的にハーモナイズされたガイドラインに従って試験室間共同試験を実施した．開発した分析法の室間再現精度は，ブラインド試料のすべての混入レベルにおいて25％を下回り，分析法の定量検知下限はISO24276に基づいて0.5％と評価された．以上の結果から，開発した分析法が実際の定量検査に適していることが確認された．%A GM maize event, MIR604, has been widely distributed and an analytical method to quantify its content is required to monitor the validity of food labeling. Here we report a novel real-time PCR-based quantitation method for MIR604 maize. We developed real-time PCR assays specific for MIR604 using event-specific primers designed by the trait developer, and for maize endogenous starch synthase lib gene (SSIIb). Then, we determined the conversion factor, which is required to calculate the weight-based GM maize content from the copy number ratio of MIR604-specific DNA to the endogenous reference DNA. Finally, to validate the developed method, an interlaboratory collaborative trial according to the internationally harmonized guidelines was performed with blind samples containing MIR604 at the mixing levels of 0, 0.5, 1.0, 5.0 and 10.0%. The reproducibility (RSDr) of the developed method was evaluated to be less than 25%. The limit of quantitation of the method was estimated to be 0.5% based on the ISO 24276 guideline. These results suggested that the developed method would be suitable for practical quantitative analyses of MIR604 maize.