Estudo comparativo e valida??o de três técnicas de PCR em tempo real (qPCR) para diagnóstico de Peste Suína Africana

摘要

Resumo: Este estudo verificou o desempenho de três técnicas de PCR quantitativa (Real-Time) para o diagnóstico de Peste Suína Africana, uma doen?a exótica no Brasil, a partir de amostras de tecidos. As três técnicas escolhidas baseiam-se na amplifica??o de sequências do gene da proteína viral VP72 e s?o preconizadas, cada uma, por laboratórios oficiais da OIE (PSA-OIE), dos Estados Unidos (PSA-USDA) e da Uni?o Europeia (PSA-EU), respectivamente. Oligonucleotídeos iniciadores e sondas de hidrólise marcadas com fluoróforos foram sintetizados conforme a literatura de referência consultada. Sequências-alvo do DNA viral foram inseridos em plasmídeo sintético, os quais serviram de controle positivo para a padroniza??o das técnicas e otimiza??o de reagentes, determina??o dos limites de detec??o e testes de verifica??o de desempenho. Para aferi??o de repetibilidade e reprodutibilidade das técnicas, as técnicas padronizadas foram repetidas em dias diferentes, por um segundo analista, com altera??o no mix comercial de reagentes utilizado e em um equipamento diferente, e também por outro laboratório. Realizaram-se, ainda, provas de sensibilidade analítica com amostras de DNA viral de referência e especificidade analítica e diagnóstica, com amostras negativas. As técnicas de PSA-EU e PSA-USDA apresentaram-se mais vantajosas quanto ao consumo de iniciadores. N?o houve diferen?as significativas nos resultados quantitativos variando-se os dias dos ensaios, os analistas, os equipamentos e o mix de reagentes. As três técnicas apresentaram alta especificidade analítica e diagnóstica e sensibilidade diagnóstica. As três técnicas de qPCR mostraram-se eficazes para serem adotadas por um mesmo laboratório para emiss?o de diagnósticos oficiais de Peste Suína Africana.