Desenvolvimento e valida??o de um método por CLAE-EM/EM para determina??o de PGE2e PGD 2 em meio de cultivo celular e avalia??o da recupera??o das prostaglandinas utilizando diferentes condi??es na extra??o em fase sólida

摘要

Tradicionalmente, estas prostaglandinas s?o quantificadas por técnicas de imuno-ensaio, que apresentam diversas desvantagens. Estes metabólitos s?o is?meros estruturais, e dessa forma é necessário o uso de técnicas de detec??o seletivas, como a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (CLAE-EM/EM). Para a extra??o de prostaglandinas de matrizes complexas, destaca-se a extra??o em fase sólida (EFS), que otimizada, fornece excelentes taxas de recupera??o. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar um método rápido por CLAE-EM/EM, para análise simultanea de PGE2e PGD2de meio de cultivo celular e avaliar a eficiência de extra??o em diferentes condi??es de EFS, em rela??o ao método proposto pelo fabricante dos cartuchos. A separa??o ocorreu com coluna de fase reversa (C18, 150mm x 2.1mm, 5μm) eluída no modo gradiente com acetonitrila e água (0,1% AFO). Dez condi??es diferentes de EFS foram testadas. O método desenvolvido foi adequado para a análise simultanea de PGE2e PGD2, apresentando resolu??o de ~1,5 entre os picos e corrida de 11 minutos. LD da ordem de 0,5 ng/mL e LQ de 1,0 ng/mL foram obtidos para ambos os analitos. A linearidade de PGE2e PGD2apresentou r>0,99. Varia??es inferiores a 6,51% e 5,93% foram encontradas para repetibilidade e precis?o intermediária, respectivamente. Foi possível diminuir perdas durante a EFS e aumentar a recupera??o dos analitos. A condi??o que ofereceu melhor eficiência de extra??o aumentou o rendimento em 181% para PGE2e 323% para PGD2, em rela??o ao método proposto pelo fabricante. Palavras-chave: PGE2. PGD2. CLAE-EM/EM. EFS. ABSTRACT Developmentand validation of HPLC-MS/MS method to determine PGE2and PGD2in cell culture medium and assessment of recovery of the prostaglandins by solid phase extraction under various conditionsPGE2and PGD2are very important pro-inflammatory mediators. Traditionally, these prostaglandins are estimated by immunoassay techniques, which have several disadvantages. Since these metabolites are structural isomers, it is necessary to use selective detection techniques, such as liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). For the extraction of prostaglandins from complex matrices, solid phase extraction (SPE) is an outstanding method that can be optimized to provide excellent recovery. The aim of this study was to develop and validate a rapid method for the simultaneous analysis of PGE2and PGD2in cell culture medium by HPLC-MS/MS and to assess the extraction efficiency of SPE under various conditions, compared to the generic method proposed by the manufacturer of the cartridges. The analytes were separated on a reversed-phase column (C18, 150mm x 2.1mm, 5μm), eluted in a gradient of acetonitrile and water (0.1% formic acid). Ten different conditions for SPE were tested. The method was suitable for the simultaneous analysis of PGE2and PGD2, showing a resolution of ~1.5 between the peaks and a run time of 11 minutes. LOD of 0.5 ng/mL and LOQ of 1.0 ng/mL were recorded for both analytes. The linearity of the analytical curves for both PGE2and PGD2showed r>0.99. Variations of less than 6.51% and 5.93% were found for repeatability and intermediate precision, respectively. It was possible to reduce the losses during SPE and enhance the recovery of the analytes. The condition affording the best extraction efficiency increased the yield by 181% for PGE2and 323% for PGD2, relative to the method proposed by the manufacturer.