Design and testing of real-time PCR primers for the quantification of Methanoculleus, Methanosarcina, Methanothermobacter, and a group of uncultured methanogens

摘要

In this study, 16S rRNA gene primers were designed to complement the suite of already available PCR primers for the detection of different methanogens involved in biogas production through anaerobic digestion by SYBR Green real-time PCR. Primers designed for use in TaqMan real-time PCR for the organisms Methanosaeta, Methanosarcina, and Methanoculleus have been described previously; however, we found that (i) the Methanoculleus primers were not specific to members of the genus and that (ii) the Methanosarcina primers did not work specifically with SYBR Green real-time PCR. Thus, we designed new primers for these and other methanogens, and we optimized SYBR Green real-time PCR assays. Primers were tested by end-point and real-time PCR, and they were found to work specifically and sensitively. Application of these primers will allow the detection and quantification of Methanoculleus, Methanosarcina, Methanothermobacter, and a group of yet uncultured archaea from anaerobic habitats.Dans cette étude, des amorces de l'ADNr 16S ont été conçues afin de compléter une série d'amorces PCR déjà disponibles permettant de détecter par PCR SYBR Green en temps réel différents organismes méthanogènes impliqués dans la production de biogaz par digestion anaérobie. Des amorces conçues pour être utilisées en PCR en temps réel avec l'enzyme TaqMan sur les organismes Methanosaeta, Methanosarcina et Methanoculleus ont déjà été décrites, cependant, nous avons trouvé que (i) les amorces conçues par ces auteurs n'étaient pas spécifiques aux membres de ce genre et que (ii) les amorces de Methanosarcina n'étaient pas spécifiques en PCR SYBR Green en temps réel. Nous avons donc conçu de nouvelles amorces pour ceux-ci et pour d'autres organismes méthanogènes et optimisé les essais en PCR SYBR Green en temps réel. Les amorces ont été testées en PCR en point final et en temps réel et se sont révélées spécifiques et sensibles. L'application de ces amorces permettra la détection et la quantification de Methanoculleus, Methanosarcina, Methanothermobacter et d'un groupe d'archées encore non cultivées présentes dans des habitats anaérobies.