沼气发酵过程中产甲烷菌分子多样性研究及产甲烷菌的分离

摘要

沼气发酵过程是一个由多种微生物联合，交替作用的复杂生化过程。在发酵过程中，不产甲烷细菌和产甲烷菌之间，相互依赖，又互相制约，在发酵过程中处于平衡状态。而在发酵过程中微生物的代谢活动与相互作用也体现在发酵反应中物料的理化性质的改变上。 在沼气发酵中，产甲烷菌是沼气发酵微生物的核心，作为自然界碳素循环中厌氧生物链的最后一个成员，分析沼气发酵过程中产甲烷菌的变化，对于了解发酵程度，优化发酵条件，提高沼气产量，具有十分重要的意义。目前已知，自然环境中的微生物有90-99％是还未可培养的，加之产甲烷菌的严格厌氧性、培养周期长等特点，使得通过传统的培养分离技术对产甲烷菌群落结构的分析十分困难，随着现代分子生物学的发展，特别是16SrDNA分析的方法引入厌氧环境微生物群落的研究中，使得快速、全面、准确地研究厌氧系统内的产甲烷菌的群落结构的多样性成为可能。 本文研究了以奶牛粪便为原料的沼气发酵过程中的物料理化性质的改变、参与发酵过程的六大微生物生理群的数量变化。同时采用不依赖于培养的16SrDNA分析的方法研究了沼气发酵的不同阶段沼液中产甲烷菌的多样性的变化。并通过传统的Hungate厌氧技术从发酵液中分离出产甲烷菌并进行了初步的鉴定。 一、沼气发酵过程中主要微生物生理群的演替与物料的变化研究了以奶牛粪便为原料的沼气发酵过程中六大微生物生理群(好氧产酸菌、厌氧产酸菌、好氧氨化菌、厌氧氨化菌、厌氧纤维素降解菌、产甲烷菌)数量的变化，以及在此过程中物料理化性质的变化。实验表明：发酵前期，以好氧微生物活动为主，随着发酵的进行，厌氧微生物，特别是产甲烷菌的作用越来越显著。 在发酵过程中，挥发性有机酸，全氮、pH、氧化还原电位都发生变化，其变化与沼液中微生物类群变化相关。 二、沼液总DNA的提取和纯化方法通过直接提取法和间接提取法的比较，确立了从沼液中提取总DNA的方法。比较结果表明，尽管直接提取法的得率要高于间接法，但由于沼液样品中的腐殖质等杂质的含量较高，经过纯化回收后的直接法提取的总DNA，仍无法通过PCR扩增的方法得到所需的片断，无法进行后续试验。而间接法的得率虽然较低，但所得总DNA纯度高，无需纯化，即可进行后续操作。 三、沼气发酵过程中产甲烷多样性的变化采用不依赖于培养的16SrDNA分析的方法研究了沼气发酵的不同阶段产甲烷菌的多样性的改变。首先提取了发酵前、发酵启动期、盛产期前期、盛产期、发酵末期五个阶段的沼液总DNA，应用产甲烷菌特异性的16SrDNA引物通过PCR扩增了五个阶段的沼液样品的总DNA，建立了五个沼液样品16SrDNA文库，应用HaeⅢ-HpaⅡ两种四碱基限制性核酸内切酶对五个文库中的16SrDNA片段进行了限制性片段长度多态性分析。共获得127种酶切类型。应用各种多样性和均度参数对五个文库HaeⅢ-HpaⅡ酶切类型的丰富度和分布进行了比较。对五个文库的16SrDNA主要HaeⅢ-HpaⅡ酶切类型的系统发育分析表明产甲烷菌群落发生了显著的变化。在发酵的五个不同阶段都存在着相同的产甲烷菌类群—甲烷粒菌，而在五个阶段也存在着各自不同的优势地位的产甲烷菌类群，如发酵前的基质中主要的产甲烷菌类群为甲烷短杆菌(Methanobrevibacter)、甲烷螺菌属(Methanospirillum)和甲烷微菌属(Methanomicrobiaceae)以及未可培养的瘤胃甲烷菌(unculturedrumenmethanogen)的成员，而发酵启动期、发酵盛产期初期、发酵盛产期的沼液中主要的产甲烷菌类群为甲烷球菌属(Methanococcus)以及甲烷粒菌属(Methanocorpusculum)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)的成员。发酵末期的发酵液主要类群则属于甲烷粒菌属(Methanocorpusculum)、甲烷袋状菌属(Methanoculleus)和鬃毛甲烷菌属(Methanosaeta)。这一结论表明，发酵起始时的优势种群并不是盛产期时的优势类群，也推翻了人们通常认为牛粪本身就含有产甲烷菌而无需调试的错误观点。 四、发酵沼液中分离产甲烷菌的分离与初步鉴定采用Hungate厌氧技术分离，从发酵前，发酵盛产期、发酵末期的沼液中各分离出一株产甲烷菌，经生理生化鉴定和系统发育分析，初步在属水平上讲NY-1确定为Methanobrevibactersp.，NF-1确定为Methanoculleussp.，NW-1确定为Methanosaetasp.。所分离到的产甲烷菌是各阶段的优势类群，但通过分子生物学方法分析得到的各阶段的最优势类群往往并没有通过分离技术得到。表明：与分子方法所得的结果既相关，又不完全一致。实际研究中，应该将两者联系起来。

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实验部分

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