Downregulation of human endothelial nitric oxide synthase promoter activity by p38 mitogen-activated protein kinase activation

摘要

Human endothelial nitric oxide synthase (eNOS) plays a crucial role in maintaining blood pressure homeostasis and vascular integrity. eNOS gene expression may be upregulated by a signaling pathway, including PI-3Kγ → Jak2 → MEK1 → ERK1/2 → PP2A. It remains unclear whether other mitogen-activated protein kinase (MAPK) family members, such as JNK, p38 kinase, and ERK5/BMK1, also modulate eNOS gene expression. Our purpose, therefore, is to shed light on the effect of the p38 MAPK signaling pathway on the regulation of eNOS promoter activity. The results showed that a red fluorescent protein reporter gene vector containing the full length of the human eNOS promoter was first successfully constructed, expressing efficiently in ECV304 cells with the characteristics of real time observation. The wild-types of p38α, p38β, p38γ, and p38δ signal molecules all markedly downregulated promoter activity, which could be reversed by their negative mutants, including p38α (AF), p38β (AF), p38γ (AF), and p38δ (AF). Promoter activity was also significantly downregulated by MKK6b (E), an active mutant of an upstream kinase of p38 MAPK. The reduction in promoter activity by p38 MAPK could be blocked by treatment with a p38 MAPK specific inhibitor, SB203580. Moreover, the activation of endogenous p38 MAPK induced by lipopolysaccharide resulted in a prominent reduction in promoter activity. These findings strongly suggest that the activation of the p38 MAPK signaling pathway may be implicated in the downregulation of human eNOS promoter activity.Le système d'oxyde nitrique synthase endothélial (eNOS) chez l'humain joue un rôle important dans le maintien de l'homéostasie de la pression sanguine et l'intégrité vasculaire. L'expression du gène codant eNOS peut être augmentée par des voies signalétiques dont la voie PI-3K → Jak2 → MEK1 → ERK1/2 → PP2A (Wu, 2002). On ne sait toujours pas de façon claire si d'autres membres de la famille des kinases MAPK comme JNK, p38 et ERK5/BMK1 modulent aussi l'expression du gène eNOS. Notre objectif est donc de faire la lumière sur les effets de la voie de signalisation de p38 MAPK sur la régulation de l'activité du promoteur d'eNOS. Nos résultats ont démontré qu'un gène rapporteur constitué de la protéine fluorescente rouge et du promoteur d'eNOS a pu être construit avec succès et exprimé efficacement dans les cellules ECV304 permettant une observation en temps réel. Les molécules signalétiques sauvages p38α, p38β, p38γ et p38δ ont toutes diminué de façon importante l'activité du promoteur, effet renversé par des mutants négatifs, dont les molécules p38α (AF), p38β (AF), p38γ (AF) et p38δ (AF). Il a aussi été inhibé par MKK6b (E), un mutant actif agissant en amont de p38 MAPK. La réduction de l'activité du promoteur par p38 MAPK a pu être bloquée par un inhibiteur spécifique de la kinase, le SB203580. De plus, l'activation de p38 MAPK endogène par le lipopolysaccharide a résulté en une réduction importante du l'activité du promoteur. Ces résultats suggèrent fortement que l'activation de la signalisation par la voie p38 MAPK pourrait être impliquée dans la diminution de l'activité du promoteur d'eNOS humain.