The Wilms tumour suppressor protein WT1 (+KTS isoform) binds alpha-actinin 1 mRNA via its zinc-finger domain

摘要

Mutations in WT1 are associated with developmental syndromes that affect the urogenital system and neoplasms, including Wilms tumour, acute myeloid leukemia, and breast and prostate cancers. The WT1 protein belongs to the early growth response family of zinc-finger transcription factors. Uniquely to WT1, an evolutionarily conserved alternative splice event inserts the tripeptide KTS, between zinc fingers 3 and 4. Whereas -KTS isoforms bind DNA and activate or repress transcription, +KTS isoforms bind DNA less efficiently and interact with splice factors and RNA in vitro and in vivo. Although candidate DNA targets have been found, physiological mRNA targets are yet to be defined. We examined the distribution of WT1 in ribonucleoprotein (RNP) complexes in nuclear extract prepared from M15 cells, a mouse mesonephric fetal kidney cell line. WT1 cofractionated with the splice factor PSF in large RNP particles ≥2 MDa. We also found that PSF co-immunoprecipitated with WT1, suggesting a functional interaction between these 2 multifunctional proteins. Using yeast three-hybrid library constructed from the co-immunoprecipitated RNA we found that WT1 (+KTS) binds close to or at the start codon of alpha-actinin 1 (ACTN1) mRNA. A band shift assay confirmed the ability of the WT1 zinc-finger domain (+KTS) to bind this sequence in vitro. ACTN1 is the first likely physiological mRNA target of WT1.Les mutations du gène WT1 sont associées à des syndromes développementaux qui affectent le système urogénital, de même qu'avec des néoplasmes incluant la tumeur de Wilms, la leucémie myéloïde aiguë et les cancers du sein et de la prostate. La protéine WT1 appartient à la famille de facteurs de transcription à doigts de zinc EGR. Un événement évolutif de l'épissage alternatif unique à WT1 a résulté en l'insertion d'un tripeptide KTS entre les troisième et quatrième doigts de zinc. Alors que les isoformes sans KTS lient l'ADN et activent ou répriment la transcription, les isoformes avec KTS lient moins efficacement l'ADN mais interagissent plutôt avec des facteurs d'épissage et des ARN in vitro et in vivo. Bien que les ADN cibles candidats aient été trouvés, les ARN cibles physiologiques restent encore à découvrir. Nous avons examiné la distribution de WT1 dans des complexes de ribonucléoprotéines (RNP) obtenus d'extraits nucléaires préparés à partir de la lignée cellulaire mésonéphrique foetale de souris M15. WT1 a co-fractionné avec le facteur d'épissage PSF dans les RNP de grande taille ≥2 MDa. Nous avons aussi trouvé que PSF co-immunoprécipitait avec WT1, suggérant la présence d'une interaction fonctionnelle entre ces deux protéines multifonctionnelles. À l'aide d'une banque de triple-hybride construite à partir de l'ARN co-immunoprécipité, nous avons trouvé que WT1 (+KTS) se liait à proximité ou au codon d'initiation de l'ARNm de l'alpha-actinine 1 (ACTN1). Un essai de rétention sur gel a confirmé la capacité du domaine à doigt de zinc (+KTS) de WT1 à lier cette séquence in vitro. ACTN1 est le premier ARNm cible physiologique probable de WT1.