Dose-dependent effect of hydrogen peroxide on calcium mobilization in mouse pancreatic acinar cells

摘要

We have employed confocal laser scanning microscopy to investigate how intracellular free calcium concentration ([Ca2+]_i) is influenced by hydrogen peroxide (H₂O₂) in collagenase-dispersed mouse pancreatic acinar cells. In the absence of extracellular calcium, treatment of cells with increasing concentrations of H₂O₂ resulted in an increase in [Ca2+]_i, indicating the release of calcium from intracellular stores. Micromolar concentrations of H₂O₂ induced an oscillatory pattern, whereas 1 mmol H₂O₂/L caused a slow and sustained increase in [Ca2+]_i. H₂O₂ abolished the typical calcium release stimulated by thapsigargin or by the physiological agonist cholecystokinin octapeptide (CCK-8). Depletion of either agonist-sensitive or mitochondrial calcium pools was unable to prevent calcium release induced by 1 mmol H₂O₂/L, but depletion of both stores abolished it. Additionally, lower H₂O₂ concentrations were able to release calcium only after depletion of mitochondrial calcium stores. Treatment with either the phospholipase C inhibitor U-73122 or the inhibitor of the inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) receptor xestospongin C did not modify calcium release from the agonist-sensitive pool induced by 100 µmol H₂O₂/L, suggesting the involvement of a mechanism independent of IP3 generation. In addition, H₂O₂ reduced amylase release stimulated by CCK-8. Finally, either the H₂O₂-induced calcium mobilization or the inhibitory effect of H₂O₂ on CCK-8-induced amylase secretion was abolished by dithiothreitol, a sulphydryl reducing agent. We conclude that H₂O₂ at micromolar concentrations induces calcium release from agonist- sensitive stores, and at millimolar concentrations H₂O₂ can also evoke calcium release from the mitochondria. The action of H₂O₂ is mediated by oxidation of sulphydryl groups of calcium ATPases independently of IP3 generation.Key words: hydrogen peroxide, pancreatic acinar cells, intracellular calcium stores, amylase secretion.Nous avons utilisé la microscopie confocale à balayage laser afin d'étudier comment la concentration de calcium intracellulaire libre ([Ca2+]_i) est influencée par le peroxyde d'hydrogène (H₂O₂) chez les cellules acineuses pancréatiques de souris dispersées à la collagénase. En absence de calcium extracellulaire, le traitement des cellules avec des doses croissantes de H₂O₂ a résulté en une augmentation de [Ca+2]_i, indiquant un relâchement de calcium à partir des réserves intracellulaires. Des concentrations micromolaires de H₂O₂ ont induit un patron oscillatoire, alors que 1 mmol de H₂O₂/L a causé une augmentation lente et soutenue de [Ca+2]_i. Le H₂O₂ a aboli le relâchement typique de calcium stimulé par la thapsigargin ou par l'agoniste physiologique CCK-8. La déplétion des réserves de calcium sensibles à l'agoniste ou des réserves mitochondriales n'a pas empêché le relâchement de calcium induit par 1 mmol de H₂O₂/L alors que la déplétion des deux réserves a pu l'abolir. Qui plus est, des concentrations plus faibles de H₂O₂ n'ont pu induire un relâchement de calcium qu'après déplétion des réserves mitochondriales de calcium. Un traitement, soit avec le U-73122, un inhibiteur de phospholipase C ou avec le xestopongin C, un inhibiteur du récepteur de l'inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3), n'a pu modifier le relâchement de calcium induit par 100 µmol de H₂O₂/L à partir des réserves sensibles à l'agoniste, suggérant l'implication d'un mécanisme indépendant de la génération d'IP3. De plus, le H₂O₂ a réduit la sécrétion d'amylase stimulée par le CCK-8. Finalement, soit la mobilisation de calcium induite par le H₂O₂, soit l'effet inhibiteur du H₂O₂ sur la sécrétion d'amylase induite par le CCK-8, a été aboli par le DTT, un agent réducteur de sulfhydryle. Nous concluons que le H₂O₂ à des concentrations micromolaires induit le relâchement de calcium à partir des réserves sensibles à l'agoniste, alors qu'à des concentrations millimolaires, le H₂O₂ peut aussi provoquer un r