颜色补偿实时定量PCR及熔解曲线快速检测载脂蛋白E基因突变

摘要

目的探讨应用颜色补偿实时定量PCR及熔解曲线快速检测载脂蛋白E基因两个密码子突变及临床应用价值。方法选取60岁以上老年非酒精性脂肪肝(NAFL)108例和体检正常老年者96例为研究对象。首先以LC-Red640和LC-Red750标记两条针对112和158位编码子的检测探针5′端,相应的锚定探针在3′端被荧光标记,再从人基因组DNA中快速循环PCR特异引物扩增apoE基因265bP片段并与特异探针杂交后,引发荧光共振能量转移,通过异源杂交的出现和错配碱基的类型的熔解参数来完成野生型和突变基因分型。结果峰值对应着序列特异的熔解温度点,各基因型的模板均呈现良好的峰形。NAFL组以杂合子E2/3、E3/4基因型频率最高,与正常组比较差异有显著意义(P0.05),分布频率为E2/3(35%)、E3/4(25%)、E3/3(35%)、E2/4(2%)、E4/4(2%)、E2/2(1%);NAFL组E4/4频率高于对照组;NAFL组apoE基因总浓度表达水平明显升高(P0.05)。结论采用PCR结合熔解曲线法进行apoE基因多态性检测,其操作简便省时,不易交叉污染;获得的各种基因类型特征性强,适用于临床快速诊断分型。apoE基因多态性与老年NAFL存在相关性,携带E3/4、E2/3型或E4/4型的个体存在,提示对老年NAFL遗传易感性方面起到重要作用。