用变性高压液相色谱技术检测耐氧氟沙星的结核分枝杆菌临床株

摘要

目的利用变性高压液相色谱（DHPLC）技术快速检测结核分枝杆菌gyrA基因的突变，从而对结核分枝杆菌是否耐受氟喹诺酮类药物做出初步判断。方法提取试验菌株基因组DNA，扩增gyrA基因的氟喹诺酮药物耐受决定区（QRDR）核酸片段；分别与H37Rv标准株（或者含有单纯Ser284突变的临床分离株作为标准）的相应PCR产物混合、杂交后，利用WAVE核苷酸片段分析系统对各杂交产物进行DHPLC检测；序列测定结果与相应的DHPLC检测结果进行比较以验证DHPLC检测的准确性。采用2mg/L的药物浓度进行氧氟沙星（OFLX）药物敏感性试验，确定101株结核分枝杆菌临床分离株对OFLX的敏感性，通过比较药物敏感性和DHPLC检测结果，建立两者之间的对应关系。结果利用DHPLC检测QRDR突变与序列测定具有同样的检出率（100％），两者都能够很好地检测QRDR突变。采用单纯含有Ser284突变的临床分离株代替H37Rv作为标准进行DHPLC检测，可以检测出除Ser284突变点外所有的点突变形式。在101株结核分枝杆菌临床分离株中，有49株对2mg／L OFLX敏感；52株耐受。52株耐药菌株中，有27株能够通过序列测定和DHPLC法得到准确判定。采用含有单纯Ser284突变的临床分离株作为标准进行DHPLC检测菌株的耐药性，检测结果更准确。结论DHPLC法是快速检测出结核分枝杆菌gyrA基因碱基突变的好方法，但是碱基突变与结核分枝杆菌是否耐受氟喹诺酮类药物存复杂的关系，因此该方法应用于临床检测尚需进一步验证。