人端粒酶逆转录酶基因转染对犬髓核细胞生物学活性的影响

摘要

目的 观察2型重组腺相关病毒-人端粒酶逆转录酶(recombinant adeno-associated virus type-2 human telomerase reverse transcriptase,rAAV2-hTERT)病毒载体转染对犬髓核细胞生物学活性的影响.方法 实验组常规分离犬髓核细胞,rAAV2-hTERT病毒载体以1×105 v.g/cell的复合感染转染犬髓核细胞.在转染后5、10、15、30 d及60 d分别以反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、Western-blot方法检测髓核细胞中hTERT mRNA及蛋白的表达;利用实时定量PCR、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法分别检测髓核细胞蛋白多糖(proteoglycan,PG)、Ⅰ型和Ⅱ型胶原(collagen type Ⅱ,COL2)mRNA及蛋白表达量.所有检测均与2型重组腺相关病毒-增强绿色荧光蛋白(recombinant adeno-associated virus type-2 enhanced green fluorescent protein,rAAV2-EGFP)转染的髓核细胞(对照组)进行对比.结果 rAAV2可成功转染犬髓核细胞,在转染后5、10、15、30 d以及60 d,均可于基因和蛋白水平检测到hTERT基因在髓核细胞内的表达;而在所有观察时间点内,对照组未能检测到hTERT基因表达.RT-PCR显示在转染后的10~60 d,实验组PG、COL2 mRNA的表达量明显高于对照组细胞的mRNA表达,实验组与对照组在COL1 mRNA表达上无明显差别.ELISA测定蛋白多糖及COL2表达量提示:在转染后10 d,实验组髓核细胞PG、COL2的表达量显著增加;在转染后的10~60 d,实验组髓核细胞PG、COL2的表达量均明显高于对照组.结论 使用rAAV2-hTERT病毒转染可成功实现体外培养条件下髓核细胞增殖能力及细胞外基质表达的上调,这将有可能为椎间盘退行性疾病的生物治疗提供更为理想的种子细胞选择.