草鱼Stefin克隆表达、纯化及活性特征鉴定

摘要

文章克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)Stefin cDNA全长序列,全长294 bp,编码97个氨基酸,无二硫键,N端存在高度保守的Gly(3、4)残基及QXVXG(45 ～49)序列,比对结果显示其氨基酸序列与Burton's mouthbrooder(Haplochromis burtoni)Stefin A1一致性最高,为47.5％.进化树分析表明草鱼Stefin A与Burton's mouthbrooder(Haplochromis burtoni、southern platyfish(Xiphophorus maculatus)、Colisa chuna(Trichogaster chuna)、lamprologini(Neolamprologus brichard)、elephant shark(Callorhinchus milii)及bieolor damselfish(Stegastes partitus)Stefin A聚为一类.将构建的原核表达载体Stefin-Pet30a转入E coli BL21,以1 mol·L-1 IPTG诱导表达重组Stefin蛋白,而后经梯度尿素洗涤和镍亲和层析纯化,并分别利用SDS-PAGE和TSK-GEL G2000SWxl高效液相色谱检测诱导及纯化效果,SDS-PAGE结果显示重组Stefin蛋白得到高度纯化,最终呈现相对分子量11.4 kD的单一条带;其在高效液相上保留时间25.98 min处亦呈单一活性峰,纯度为96.28％.以荧光合成肽底物(Z-Phe-Arg-MCA)测活法鉴定重组草鱼Stefin对鲤鱼组织蛋白酶B、L的抑制活性,发现该重组蛋白对二者均体现了明显的抑制活性.