超声波在电镜样品制样过程中的应用

摘要

骨组织尤其是密质骨 ,其矿物质(又称骨盐)干重约占骨的65%～75%.其中95%是固体钙和磷,钙磷固体以结晶的羟基磷灰石形式存在,不溶于水,它使骨质十分坚硬,采用常规电镜样品制样方法 ,超薄切片困难,因此用于电镜观察的骨组织通常都需经过脱钙处理.络合剂乙二胺四乙酸 (ethylene diamine tetraacetic acid,简称EDT A)是最常用的脱钙剂.对于1×3×0.2mm3体积的骨片,在常温下EDTA常规的脱钙时间需20d左右,致使骨标本的电镜制样周期很长.实验过程中我们发现应用超声波对骨组织进行脱钙,可大大缩短骨标本的电镜制样周期.rn取正常SD大鼠股骨中段,剪成面积约1×3mm2的小骨片,迅速投入4%甲醛-5 %戊二醛混合固定液中(0.1mol/L磷酸缓冲液配制,pH7.4),4℃固定2h 以上,再用0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗3次,每次15min,分成二组进行脱钙. ①超声实验组:样品投入5%脱钙液,并用21kHz超声波,水浴内对浸泡在脱钙液内的样品进行连续辐照,持续时间为20min,随后静置在室温.如此超声辐照每天一次,持续7d.每隔24h更换脱钙液一次.②对照组:依常规脱钙程序,样品投入脱钙液于室温静置,每隔24h更换脱钙液一次,持续20d.脱钙后的样品,经磷酸缓冲液漂洗,1% 四氧化锇后固定2h,梯度乙醇逐级脱水,丙酮置换,国产618环氧树脂浸透后包埋,L eica公司 Reichert Ultrcut E超薄切片机切片(切片厚度约60n m),醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色,最后经JEOL公司JEM-1200EX透射电镜观察、摄片.rn实验结果表明,经超声脱钙7d实验组的骨组织在切片过程中未遇困难,电镜下观察,间质胶原微纤维上未见无机盐结晶,周期性横纹清晰可辨,骨陷窝内的骨细胞保存完好,未发现线粒体与内质网的形态改变.细胞核卵圆形,核膜完整,基本达到了与常规方法脱钙相同的实验效果.说明超声EDTA方法是一种简便、有效的骨组织脱钙技术.因而克服了常规骨组织电镜样品制备周期长的缺点.