mleA基因在酿酒酵母中的整合型表达

摘要

[目的]进行中国自行筛选的专利菌种酒酒球菌SD-2a(Oenococcus oeni SD-2a)的苹果酸-乳酸酶基因在酿酒酵母中的整合型表达,使葡萄酒生产过程中的酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation,MLF)同时进行. [方法]克隆Oenococcus oeni SD-2a的苹果酸-乳酸酶基因mleA,以PGK1强启动子和ADHl终止子为调控元件,以酵母整合型质粒YIp5为载体,构建重组表达质粒pYILmleA,并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS59,经筛选鉴定获得酵母转化子YS59/pYILmleA.进行转化子的营养缺陷型和交配型鉴定、菌落PCR鉴定、SDS-PAGE检测及斑点杂交检测,并对酵母转化子培养上清液进行L-苹果酸及L-乳酸含量的HPLC分析,检测目的基因的功能性表达.[结果]转化子的营养缺陷型和交配型鉴定、菌落PCR鉴定表明获得了阳性转化子;SDS-PAGE检测表明获得的转化子表达了目标蛋白,斑点杂交检测表明目的基因整合到受体菌中.模拟发酵表明mleA基因整合到受体菌中后进行了功能性表达,将培养基中的L-苹果酸转化成L-乳酸,使得培养液中的L-苹果酸含量极显著降低.转化子YS59/pYILmleA在添加5 648 mg·-1 L-苹果酸和10%葡萄糖的SD/-Ura培养基中培养4 d,培养液上清中L-苹果酸的剩余含量与空载体转化子YS59/YIp5(对照)差异极显著,苹果酸的相对降低率为20.18%-20.85%.供试的转化子L-乳酸生成量为1 278～1 312 mg·L-1,对照未检出乳酸的生成.[结论]中国自主筛选的专利菌种O.ocni SD-2a的mleA基因的整合型表达质粒构建成功并在酿酒酵母中进行了功能性表达.