牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立

摘要

[目的]建立高通量牛布鲁氏菌间接ELISA诊断方法,为科学高效诊断牛布鲁氏菌病提供技术手段.[方法]以提纯的猪布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS)作为包被抗原,采用棋盘滴定法确定了抗原包被浓度、包被液、抗原包被时间、封闭液、样品稀释液、血清稀释倍数、兔抗牛酶标抗体稀释液、兔抗牛酶标抗体稀释浓度、最佳TMB底物反应时间等参数,初步建立了牛布鲁氏菌间接ELSIA方法.并用上述条件初步建立的方法对176份牛布鲁氏菌病阳性血清和1 32份牛布鲁氏菌病阴性血清进行检测.检测结果经SPSS17.0软件分析,构建受试者工作特征曲线(ROC)及曲线下面积,确定敏感性和特异性;通过Youden指数确定阴阳性判定的临界点.使用质控阴、阳性血清评价试剂金的批内和批间重复性.用本研究建立的ELISA试剂盒及商品化试剂盒同时对临床上1200份牛血清样本进行比对检测,比较其符合率.[结果]通过棋盘法确定的试剂盒中各组分的最佳条件为:抗原包被浓度为10 μg·mL-1,最适包被液为碳酸盐缓冲液,最佳包被时间为2-8℃、16 h,最适血清稀释度为1∶50,最佳封闭液为含有3％明胶的PBST,最佳样品稀释液为含有0.5％蔗糖的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体稀释液为含有5％马血清的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体工作浓度为1∶20 000,最佳TMB底物反应时间为15 min.按上述条件建立的间接ELISA方法检测176份牛布鲁氏菌病阳性血清和1 32份牛布鲁氏菌阴性血清,并统计结果后使用SPSS17.0软件分析该方法受试者工作特征曲线(ROC)线下面积为0.98.最佳判定临界点为样本OD值/阳性0D值(S/P)×100％=20％.在此临界值上时,敏感性为97.7％,特异性为95.5％.对1 200份临床样本的比对检测显示,本研究建立的间接ELISA方法与进口商品化试剂盒的总符合率为96.25％.[结论]建立了特异性和敏感性良好的牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法.