致倦库蚊防御素基因的克隆与原核表达及蛋白纯化

摘要

以冈比亚按蚊防御素(Defensin)氨基酸序列为种子序列,在致倦库蚊EST库中查找相似序列.通过RT-PCR技术,克隆获得致倦库蚊防御素编码序列.将致倦库蚊防御素成熟肽基因片段定向克隆至原核表达载体pET32a(+),构建致倦库蚊防御素重组表达质粒pET32a-DEF,导入大肠埃希菌Rosetta中表达,并比较不同IPTG浓度、不同诱导时间、不同诱导温度对重组基因表达的影响,以确定最佳诱导表达条件,重组蛋白经His-镍蛋白纯化柱纯化.结果表明,致倦库蚊防御素基因编码区全长300 bp,编码99个氨基酸.pET32a-DEF最佳诱导表达条件为,IPTG浓度0.2 mmol/L,诱导时间为4h,诱导温度为37℃,经纯化获得大小约29 ku的重组蛋白,这为进一步研究该蛋白功能奠定了基础.