大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的原核表达及免疫原性分析

摘要

构建大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(Fg.TPx)原核表达质粒,经大肠埃希菌Rosetta表达融合蛋白(Fg.TPx/His)并对其进行纯化和初步鉴定.PCR扩增Fg.TPx的基因片段,亚克隆至pET32a(+)中构建重组表达载体pPET32a-Fg.TPx.IPTG诱导表达,经镍离子亲和层析分离纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析.重组质粒经限制性内切酶双酶切和测序分析表明构建成功,表达产物以可溶性和包涵体形式存在,纯度为90％,Wsetern blot证实该蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合反应,分子质量为TPx和His分子质量之和,表明是融合蛋白.重组蛋白可以被大片吸虫感染水牛阳性血清特异性识别.免疫家兔产生的抗体效价最高可达1∶4 000.成功构建了p ET32a-Fg.TPx原核表达质粒,重组蛋白得到高浓度表达,具有抗原性,为进一步研究其在大片吸虫病诊断中的应用奠定了基础.