鞭毛蛋白FliC突变体/HPV 18 L2N融合蛋白的表达与纯化

摘要

目的:人乳头瘤病毒(HPV)的持续性感染导致女性宫颈癌的发生.HPV的次要衣壳蛋白L2可以诱发交叉中和多种型别HPV的中和抗体,但是单独免疫L2诱发的抗体滴度较低.鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC是一种有效的佐剂.删除FliC超变区域的突变体可与外源抗原融合表达并且显著增强外源抗原特异性抗体的产生.本研究旨在构建鞭毛蛋白FliC超变区删除突变体与HPV 18 L2N(aa.13-154)的融合基因,通过大肠杆菌原核表达系统表达FliC突变体与HPV 18 L2N的融合蛋白并纯化,为研究鞭毛蛋白的佐剂活性及新型HPV 18L2疫苗奠定基础.方法:以鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白编码基因fliC为模板,通过重叠PCR法构建删除fliC D3区域(fliC△D3)、D3+CD2a区域(fliC△D3CD2a)、D3+D2区域(fliC△D2D3)的突变体,同时将HPV 18 L2N基因插入置换突变体的超变区删除区域.含有重组基因的表达载体在大肠杆菌中诱导表达,经SDS-PAGE及Westem blot鉴定分析.表达的融合蛋白经Ni-Sepharose亲和层析纯化及Q-Sepharose离子交换层析去除内毒素.纯化后的融合蛋白经Native-PAGE鉴定分析,通过鲎试剂凝胶法测量蛋白溶液中的内毒素含量.结果:构建了pET22b-fliC△D3/18 L2N、pET22b-fliC△D3CD2a/18L2N、pET22b-fliC△D2D3/18 L2N重组载体.重组载体在大肠杆菌以包涵体形式高效表达,且主要以单体形式存在.结论:通过原核表达及层析法纯化,成功获得了无热源、高纯度的鞭毛蛋白FliC突变体与HPV 18 L2N的融合蛋白,为增强HPVL2免疫原性提供了一种新的途径,为进一步研制HPV 18 L2疫苗奠定了基础.