慢病毒介导的小鼠PINK1基因RNAi载体的构建及在NIH3T3细胞中的筛选

摘要

目的:构建筛选靶向特异PINK1-siRNA慢病毒表达载体,感染小鼠胚胎细胞(NIH3T3)验证该病毒载体的敲减效率,为研究帕金森病的发病机制奠定基础.方法:构建2对靶向小鼠PINK1-siRNA序列(KD1和KD2),将这2对序列连接在GV118上,将重组载体和病毒包装的辅助质粒共转染293T细胞,获得慢病毒颗粒,再将该病毒颗粒转染入NIH3T3细胞,用qRT-PCR验证细胞内PINK1 mRNA表达水平以验证敲减效果.结果:筛选出可以用于后续实验的高效靶向KD2序列,并成功转染到小鼠NIH3T3细胞中,在感染复数(MOI)为50时,KD2的沉默效果最好,敲减率达到66.4％.结论:成功构建了高效靶向小鼠PINK1-siRNA慢病毒载体,其可稳定转染小鼠NIH3T3细胞,可高效抑制PINK1 mRNA的表达.为下一步利用其感染神经细胞或注入动物脑内,进一步研究PINK1基因在帕金森病发病过程中的作用环节和机制提供了分子生物学的技术基础.