C端融合RGD三肽的重组L-门冬酰胺酶基因克隆、表达和对血液系统的影响

摘要

利用加端PCR技术构建asnB-RGD工程菌,获得C末端带有RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸,Arg-Gly-Asp)三肽的门冬酰胺酶(AnsB-RGD),以改进L-门冬酰胺酶的作用.以pUA18为模板,利用pUC18上游普适引物和根据L-门冬酰胺酶Ⅱ基因(ansB)C末端下游序列设计的引物来扩增目标基因.将目标基因连于pMD18-T载体,转化宿主菌JM109,筛选出的阳性克隆通过HindⅢ、NcoⅠ双酶切下目标基因连到含T7启动子的高效表达载体pET28a上,再转化BL21宿主菌.高效表达的工程菌摇瓶发酵,渗透休克法提取AnsB-RGD融合蛋白,12%的SDS-PAGE检测酶蛋白并考察酶的活力、特异性及其对血液系统的影响.2%琼脂糖凝胶电泳、DNA测序鉴定构建的pET28a-ansB-RGD工程菌,奈氏法、SDS-PAGE及免疫学方法检测AnsB-RGD融合蛋白.DNA序列分析证明RGD三肽已经连接在L-门冬酰胺酶的C末端,带有RGD三肽的融合蛋白仍然能与抗L-门冬酰胺酶的抗体结合,初步发现AnsB-RGD融合蛋白有促进血液凝固作用,但酶活力下降.